电生理膜片钳实验操作方法探讨

电生理膜片钳实验操作方法探讨

作者：张永宁

来源：《科教导刊》2018年第03期

摘 要 膜片钳技术是生命科学研究中的重要技术手段，利用膜片钳技术可以准确地记录到细胞膜上离子通道的电活动和囊泡的分泌特性。在神经科学方面，膜片钳技术有助于阐明神经元内部蛋白分子的生理活动和功能，探究相关疾病的分子机制并提供潜在的治疗方法。但是，膜片钳实验的操作却有一定难度，初学者需要经过系统学习和长时间练习才能很好地掌握操作方法。本文以最常见的电压钳全细胞模式为例，结合膜片钳的具体操作过程，陈述了实验操作中应该特别注意的一些细节和问题，以协助实验人员记录到有效的实验数据。 关键词 膜片钳技术 操作方法 全细胞模式

中图分类号：G2 文献标识码：A DOI：10.100/j.cnki.kjdkx.2018.01.020 Discussion on Experimental Operation Methods of Electrophysical Patch-clamp ZHANG Yongning

（College of Biomedical Engineering， South-central University for Nationalities， Wuhan， Hubei 430074）

Abstract Patch-clamp technique plays an important role in life science research， which can accurately record the electrical activity of ion channels on cell membrane and vesicle secretion

characteristics. In neuroscience， patch-clamp technique helps to elucidate the physiological activity and function of protein molecules in neurons， explore the molecular mechanism of related diseases and provide potential therapeutic methods. However， the operation of patch-clamp experiment is difficult and beginners need to learn and practice for a long time to master the operation method. In this paper， the voltage-clamp whole-cell model were presented as an example， and according to the specific operation process of patch-clamp， some details and problems which should be paid special attention to in the experimental operations were stated， and this can help experimental operators get effective experimental data.

Keywords patch-clamp technique； operation methods； whole-cell model

膜片钳技术是物理学和生物学的交叉学科，自其问世以来对细胞生物学和电生理学产生了巨大的推动作用，尤其是在神经科学方面，基于膜片钳技术，对癫痫、神经病理性疼痛、神经退行性疾病（如阿尔兹海默症）等的电生理和分子机制的研究上取得重大进展，与这些疾病相

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关的神经元电活动和致病机理被逐渐阐释出来，为这些疾病的治疗提供了潜在的治疗方法。目前，膜片钳技术已经成为神经科学实验室进行研究的重要手段，所记录的神经元电活动主要包括动作电位、细胞膜上的离子通道电流、基于神经元囊泡释放而产生的兴奋性突触后电流等，神经元电活动可以直观地反映出神经元本身及其内部蛋白分子的生理活动和功能。越来越多的实验室把膜片钳技术运用到各自的研究领域，但是膜片钳实验操作却有一定难度，要记录到有效的实验数据，就需要操作人员进行系统学习理论知识和长时间的实践练习。在实验操作过程中，实验人员必须要注意诸多细节，才能确保记录到可靠的细胞电信号。本文以最常见的电压钳全细胞模式为例，结合膜片钳的具体操作过程，把实验人员需要着重注意的一些细节和几点操作经验，逐一进行陈述。

1 电生理膜片钳实验操作的基本流程

电生理膜片钳实验的操作流程并不复杂，熟悉其操作流程是做好膜片钳实验的第一步。首先，在显微镜下选定一个细胞置于视野，用注射器向三通内注入少量空气（施加正压）并关闭三通；其次，操作微操，使玻璃微电极接触细胞，打开三通，放掉正压，并施加少量负压，关闭三通，使电极尖端与细胞膜紧密封接，封接阻值达到G 水平；然后，进行快速电容补偿（C-Fast），并打开三通，轻轻给负压，破膜；形成全细胞结构以后，进行慢速电容补偿（C-Slow）；另外，在此过程中，调节钳制电压，使其和刺激方案中的钳制电压值相等；最后，点击刺激方案，记录细胞电信号。 2 封接时需要注意的问题

封接是膜片钳实验操作中的几个难点之一，玻璃微电极尖端和细胞膜之间的良好封接，是记录细胞电信号的前提，也是熟练操作膜片钳系统的基础。电极尖端和细胞膜之间的阻值一般达到1G 以上即可认为封接良好，但是对于初学者来说，封接阻值达到G 以上需要经过长时间的摸索和练习。封接的快慢以及好坏受到诸多因素的影响，比如，HEK 293细胞、离体中枢神经元等封接比较容易，而脑片、外周DRG细胞等封接比较困难，即不同的细胞或组织的封接难易程度是不同的。另外，细胞状态的好坏也是影响封接的重要因素，细胞状态好，细胞膜表面比较光滑，则容易封接，细胞状态差，细胞膜表面比较松散，则难以封接。除此以外，细胞膜表面的洁净程度、施加正压的大小、玻璃微电极尖端是否经过热抛光、实验人员的操作手法等都会对封接过程造成影响。针对以上这些影响因素，在实验操作过程中应该着重注意以下问题：（1）玻璃微电极应该进行热抛光。硅酸盐玻璃微电极经拉制仪拉制后，电极尖端并不圆滑。对于有些细胞种类来讲（比如外周DRG细胞），直接用没有经过抛光的电极进行封接则难度很大，所以对拉制好的玻璃微电极进行热抛光是必不可少的过程。（2）施加正压时，用注射器注入1mL 左右的空气。封接之前，施加正压的原因有三个，其一是防止细胞外液与电极内液混合；其二是防止外液中的杂质堵住电极尖端，影响封接；其三是放掉正压的时候，封接阻值会有一个瞬时上升，有助于封接。施加正压的方法一般有两种， 一是用嘴轻轻吹气，二是用注射器注入空气，但是最好使用注射器施加正压的方法，这样可以更精确地控制注入气体的量。另外，根据实际操作经验，当注入气体的体积在1mL 左右时，封接较容易。（3）施加正压后，玻璃微电极应尽快接触细胞，防止因间隔时间太长，而将施加的正压消耗掉，从而

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影响封接。（4）玻璃微电极进入外液以后，最好把电极尖端置于细胞右侧（即与Holder同侧）三分之一处。因为细胞胞体近似于球形，细胞表面有一个拱起来的弧度，电极尖端越和细胞膜契合越好封接。（5）电极尖端接触细胞膜以后，最好操纵微操继续下压，使细胞膜和电极尖端之间的阻值比接触之前增加1～2 M ，电极和细胞膜接触得越紧密越有利于封接。当然，记录脑片神经元电信号时，由于所记录的神经元位于脑片组织内部，阻值上升的现象并不明显，此时就不能根据阻值上升的大小来判断是否应该停止下压，而应该观察神经元表面是否被电极尖端压出了明显的凹窝，如果出现一个明显的凹窝，则停止下压。（6）封接完成，阻值达到G 以后，不要急于破膜，最好等待1min 左右，使其封接更加牢固，然后破膜。如果急于破膜，则很可能会因为封接不牢固而导致电极尖端在细胞膜上的脱落。 3 破膜时需要注意的问题

记录全细胞（Whole cell）电信号时，必须要经过破膜的步骤，使电极和细胞之间形成全细胞结构。但是，破膜往往会造成电极和细胞膜之间封接的不稳定，破膜是电生理膜片钳实验操作的基本流程中难度比较高的环节，所以在进行破膜操作时应该特别小心，造作人员应该特别注意以下几个问题：（1）破膜时施加负压，最好不要采用注射器。打破细胞膜需要一个瞬时的小的爆发力，使用手抽注射器的方式不好控制施加负压的大小，往往会造成电极尖端从细胞膜表面上脱落，或者即使破膜，也会导致破膜以后电极尖端和细胞膜之间的阻值过低，无法记录到有效的数据。而用嘴吸气的方式，破膜效果往往比较好，因为嘴巴可以很好得控制吸气力度和所施加负压的大小，给细胞膜一个适当的瞬时爆发力，从而提高破膜成功率。（2）破膜以后，电极尖端和细胞膜之间的阻值应该保持在G 水平。破膜的难度最大之处就在于破膜以后的阻值能否仍然保持在G 水平，如果阻值不能保持在G 水平，就会导致记录到的电信号漏流过大，降低数据的有效性。若想要破膜以后的阻值依然保持在G 以上，除了注意破膜方法以外，经常性的操作练习是必不可少的。（3）破膜和慢速电容补偿以后，串联电阻（Rs）的阻值应该在10M 以下。如果Rs的值过大，则说明破膜不完全，记录到的电流会比正常值减小，电位也会出现异常。慢速电容补偿以后，若发现Rs的值在10M 以上，最好继续给负压，使得破膜完全。

4 记录时，针对细胞膜回封（Reseal）需要注意的问题

对细胞进行电信号记录时，如果发现电流或者电位逐渐异常，就应该检查细胞膜是否发生了回封。所谓“回封”，就是指破膜完成后，细胞膜又逐渐封合起来，使得记录不能正常进行。细胞膜回封是比较常见的问题，但是如果应对不力，解决不好，就会对实验的进行造成严重阻碍。对此，应该注意以下两点：（1）破膜和慢速电容补偿以后，最好用嘴巴再给一点负压，并关闭三通，使电极内部一直保持有负压的状态，这样就可以很好地防止细胞膜再次封合。（2）记录电信号时，若发现细胞膜已经回封，应该再次给负压，关闭三通，并进行慢速电容补偿，然后继续记录。

综上所述，电生理膜片钳技术在生命科学，尤其在神经科学方面，正发挥着巨大作用，推动着新的理论、新的机制、新的治疗方法不断发展。膜片钳是一个相对复杂的系统，其理论性

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和实践性高度融合，并且交叉着生物医学、物理学和电化学的相关知识。实验人员要在系统学习膜片钳理论知识的基础上，针对其各个操作流程多加练习，尤其在封接和破膜等方面多下功夫。封接和破膜难度比较大，对实验人员操作技巧的要求比较高，但只要在做实验时多留意一些细节，多注意一些问题，多总结一些操作技巧，就完全可以做到又好又快地记录到有效的实验数据，更好地完成相关科研任务。 参考文献

[1] 刘振伟.实用膜片钳技术.北京：军事科学出版社，2006 [2] 康华光等.膜片钳技术及应用.北京：科学出版社，2003. [3] .膜片钳实验技术.北京：科学出版社，2001.