几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

doi: 10.131%. cnki. 1671-7236.2018.05.015

中国畜牧兽医 2\"18!5(5) :124!1250

几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

杨坤明1，任航2，苏雅婷2，郭小华2 \"

(1.湖南正虹科技发展股份有限公司，岳阳414418&.中南民族大学生命科学学院，

武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

摘要：为比较几种商用益生芽孢的菌株特性，为芽孢杆菌的选育提供理论基础，本试验收集整理了 1(Y1$

5种药用

Y6)和饲用益生芽孢杆菌（S7$S15)产品，对其芽孢杆菌进行分离鉴定，分别从产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶

等酶活特性，抗菌活性，耐酸和耐0.3%胆盐稳定性，抗生素敏感性，耗氧及生长速率测试等方面对芽孢杆菌特性进 行了比较研究。结果显示，分离的15株芽孢杆菌均能产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，但不同菌株产酶能力差异较 大，S=菌株表现出较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活力；所有分离的芽孢杆菌均能对金黄色葡萄球菌及藤黄微 球菌产生显著抑制活性，但只有7株芽孢杆菌（¥2、¥6、37』9、310、311、312)可对大肠杆菌产生抑制作用，尤其是 S9菌株综合抗菌能力最强。S9Y2和S8的营养体细胞具有较高的耐酸能力，S9Y2菌株在0. 3%胆盐环境中存 活率超过90%。15株芽孢杆菌中有3株饲用来源菌株（S10、S12、S13)表现出对红霉素的耐受，S10菌株对四环素 耐受。此外，S9菌株具有较快的耗氧速率和生长速率。上述结果表明，S9菌株(解淀粉芽孢杆菌）的益生特性更为

、

、

优良，本试验结果可为芽孢杆菌益生菌的选育及活性评价提供参考依据。关键词：芽孢杆菌；益生菌&寺性比较中图分类号：S816. 7

文献标识码：

A 文章编号：167!7236(2018)05-124!10

Comparative Evaluation of Probiotic Characterization of Commercial Bacillus Products

YANG Kunming1，REN Hang2，SU Yating2，GUO Xiaohua2\"

(1.

Hunan Zhenghong Science and Technology Develop Co. ， Ltd. ， Yueyang 414418, China ；

2. Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in WuUng Area of China， College of Life Science，

South-Central University for Nationalitiss， Wuhan 430074， China)

products were compared using

Abstract ： The probiotic characteristics of commercial Bacillus

screening techniques in this study. Fifteen samples of medicinal (Y1-Y6) and feed sources(S7-S15) commercial Bacillus probiotics were collected to isolate and identify the Bacillus spp.， and their probiotic characteristics were compared including enzymic properties of amylase, cellu- lase and protease,antimicrobial activities, tolerance tests to acid and 0. 3% bile salts， antibiotics sensitivity, oxygen-consumptions rate and by S9 strain

was

the

highest. All

growth rate. The results strains could inhibit the

showed that strains of

all

could produce amylase, cellulase and protease with different enzyme capacity, and that produced

t

Staphyloc

Micrococcus luteus. Only 7 strains (Y2 , Y6 , S7 , S9 , S10 , S11 and S12) showed antimicrobial activi­

ty against E. coii. And the S9 strain showed the highest antimicrobial activity against all the three

indicator bacteria. The vegetative cells of S9,Y2 and S8 had a strong tolerance to low acid envi-

收稿日期：2017-11-26

基金项目：国家自然科学基金项目（31672455);中南民族大学横向合作项目（HZY17001)

作者筒介：杨坤明（1966-)，男，湖南长沙人，硕士，研究方向：动物营养与词料科学，E-mail:alskyloo@sina. com

\"通信作者：郭小华（1978-)，男，湖北武汉人，教授，硕士生导师，研究方向：益生菌作用机制及其应用，E-mail:gUo_xh®hotmail. com

1242

中国畜牧兽医45卷

ronment and the survival rates of S9 and Y2 strains were

resistant

in 0. 3 C bile salt eS10

90%. Three strains (S10，S12 andS13) S9 strain

identified as

to erythrocin and s

to tetracycline. The S9 strain grew faster with higher rate of oxygen consumption. In conclusion，

Bacillus amyloliquefaciens showed better beneficial

the 15 commercial probiotic Bacillus strains,and the study results could provide references for the selection and evaluation of probiotics of Bad11us.Key words： Bacillus ； probiotics ； characterization comparison

芽孢杆菌是一类好氧微生物，可通过抗菌作用、 用芽孢杆菌活菌制剂15种，其中药用芽孢杆菌活菌 c

促消化代谢活性及生物夺氧促进厌氧微生物生长从 而保持肠道微生态系统平衡[12]。不同于非芽孢类 的活菌制剂，芽孢杆菌具有良好的贮藏稳定性，能通 过胃肠道并保持活性。芽孢类的微生态制剂现已广 泛用于人膳食补充剂甚至药物制剂中，其作为饲料 添加剂能有效改善肠道菌群结构平衡，并减少抗生 素的使用）]。百益多是一种由地衣芽孢杆菌和枯草 芽孢杆菌混合的微生态制剂，可有效降低仔猪的发 病率和死亡率4 ;由枯草芽孢杆菌C-3102为主要成 分的微生态制剂——

可速必宁，可明显促进肉鸡和

猪仔的生长[5];Toyocerin作为一种已经上市的微生 态制剂，其主要成分为东洋芽孢杆菌，可降低猪仔腹 泻及细菌感染的患病率，且可提高仔猪增重）];枯草 芽孢杆菌AMS6作为动物饲料添加剂，可促进动物 胃肠道消化纤维和维持胃肠道健康）];纳豆芽孢杆 菌和凝结芽孢杆菌能吸附肠道上皮细胞，具有抗炎 作用）];整肠生具有显著的抗腹泻效果[9]。芽孢杆 菌在动物胃肠中的益生机制主要与其抗菌活性、代 谢酶活性、生物好氧、免疫调节等密切相关[，0]。与 其他种类益生菌不同，芽孢杆菌作为一种好氧微生 物（动物的胃肠道是一种厌氧或微好氧的环境），并 非肠道中的固有菌群，且芽孢杆菌作为活菌使用时 是以芽孢的形式摄人的，其在体内发挥相应的代谢 活性存在芽孢萌发和增殖的问题[10]。故目前对于 益生芽孢杆菌的选育标准及其相应作用机制尚不十 分明确。益生芽孢杆菌产品种类很多，使用的菌株 特性各不相同，在体内发挥的作用效果亦不完全一 致。本试验对药用和饲用益生芽孢杆菌相关产品中 使用的芽孢杆菌进行分离鉴定，根据现有的益生菌 的部分选育标准对菌株进行综合比较，以期归纳总 结其共性特征，为益生芽孢杆菌的选育提供参考。

1

材料与方法

1.1材料

1.1.1试验样品

收集市面上常用的药用及饲

制剂编码为Y1$Y6,饲用芽孢杆菌活菌制剂编码 为S7$S15,以进行芽孢菌株的分离、鉴定和益生特 性的比较。

1.1.2 培养基配制

LB培养基（1L):蛋白胨

10 g、NaCl 10 g、酵母浸粉5 g，pH为7.0;蛋白酶培 养基（1L):牛肉膏3 g、酪蛋白10 g、NaCl 5 g、琼脂 15 g;淀粉酶培养基（1L):牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、 NaCl 5 g、可溶性淀粉2 g、琼脂15 g;纤维素酶培养 基（1 L)蛋白胨5 g、酵母浸粉0. 5 g、KH2P041. 5 g、MgS04 0. 2 g、NaCl 5 g、CMC-Na 10 g。 1.1.3指示菌

革兰氏阳性菌:金黄色葡萄球菌

(Sa 灿 y/ococcs aues IVDC C56005)、革兰氏阴 性菌：大肠杆菌 K88 ( £c/iedcda cod IVDC C83901)均购自中国兽医微生物菌种保藏中心；革 兰氏阳性菌：藤黄微球菌（Micrococs lues)由本 实验室自行保存。将活化后的指示菌分别接种到 LB液体培养基中，37 °C培养12 h备用。

1.2芽孢杆菌的分离纯化

将不同来源的芽孢杆菌制剂溶于无菌水中，振 荡均勻，于80 C水浴中处理15 min,用接种环蘸取 水浴后的菌悬液在LB平板培养基中交叉划线， 37 C培养24 h;挑取典型单菌落接种到斜面培养基 中37 C培养24 h后保种，4 C保藏。

1.3 芽孢杆菌16SrDNA鉴定

采用基因组DNA提纯试剂盒分别提取15种 芽孢杆菌样品基因组DNA，进行常规PCR反应，利 用通用引物对全长16S rDNA序列进行扩增和双向 测序，引物序列：27F: 5LAGAGTTTGATCATG- GCTCAG-3,; 1492R: 5-TAGGGTTACCTTGT- TACGACTT3。将PCR扩增序列进行NCBI BLAST比对，对菌株进行初步鉴定。

1.4芽孢悬液及营养体悬液的制备

将斜面芽孢种转接到LB斜面试管中，37 C培 养72 h后镜检无营养体细胞后，用无菌水洗涤斜面 菌成芽孢悬液，80 C水浴15 min,将制备的芽

5期杨坤明等：几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

1243

孢悬液6 000 r/min离心10min，收集芽孢体，用无 菌水洗涤2次后，将菌体重悬在Tris-HCl缓冲液 (pH 8. 0, 50 mmol/L，下同）中，稀释调节初始D_nm为1. 0左右。

营养体的制备则采用改良的LB培养基（在LB 培养基的基础上添加2g/L谷氨酰胺和50g/L葡 萄糖），37 °C培养12h，取样镜检，确保菌悬液均为 营养体后，将菌悬液6 000 r/min离心10 min,收集 菌体，用无菌水洗涤2次后重悬于Tris-HCl缓冲液 中，稀释调节初始D_nm为1. 0左右制成营养体 (C )=试验组 D600 nm/对照组 D600 nm X 100 C。1.5.5抗菌药敏感性

参照刘清源等）4]方法，

取100 ,L芽孢悬液涂布在LB平板培养基上，用慑 子将不同抗生素试纸贴在上述平板上，37 C倒置培 养12 h左右，通过测量抑菌圈直径判断各个菌株对 于不同抗菌药的敏感性。1.5.6耗氧与生长曲线的测定

取100 mL厌

氧瓶装人60 mLLB液体培养基，并用橡胶塞密封， 121 C灭菌处理15 min。冷却后采用一次性注射器 按照1C接种量接种，37 °C、200 r/min振荡培养。 悬

'

1.5益生特性比较

1.5.1产酶特性

采用陶荣霞[11]水解酶测试方

法分别制备蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶平板培养基。 将制备好的15种芽孢悬液分别用无菌牙签点种于 3种选择性平板培养基中，37 C培养3\"蛋白酶 活性通过直接观察水解圈直径测定；分别通过刚果 红、碘液显色测定水解圈直径测定纤维素酶活性和 淀粉酶活性。1.5.2抗菌特性 参照Guo等)12]方法，将制备

的芽孢悬

无菌

于 LB

养

中，37 C培养24h，然后把平板倒扣于盛有一薄层 氯仿的培养皿盖上并熏蒸约40 min,以杀死活细胞 并让菌落固定于平板的表面，移去培养皿盖并让平 板里的残余氯仿彻底挥发30 min。在平板表面铺 一层刚培养好的指示菌培养液，均勻布满后倾倒出 剩余的菌液，晾干平板，37 C培养16$18 h，以点种 的芽孢杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度判断受试 菌对指示菌的抗菌能力。1.5.3耐酸特性

因芽孢杆菌的芽孢体对低酸

性条件均具有良好耐受能力，故只测定了不同芽孢 杆菌的营养体细胞在低酸性条件下的存活率。将制

备好的营养体悬液6 000 r/min离心10 min,收集 菌体。参考任平等）3]方法，将菌体重悬于pH为2. 0、3.0和7.0的生理盐水中，振荡处理3h，迅速 取样、稀释进行平板涂布计数。将测定的细胞浓度 转换为对数值，并以pH为2. 0或3. 0的对数值/ pH 7. 0的对数值作为芽孢杆菌营养体细胞在酸性 条件下的存活率。1.5.4胆盐耐受性

将胆盐直接溶解在LB液

体培养基中，采用0. 22 ,m的无菌过滤器过滤除 菌，接种1C新鲜种子液。同时以不添加胆盐的 LB培养液做培养对照，37 °C、200 r/min振荡培养 12 h，分别取样测定发酵液的D_nm，芽孢存活率

每隔30 min,无菌注射器取3 mL样品到10 mL的 离心管中，并立即插人溶氧仪（雷磁JPSJ-605F)的 溶氧电极测量溶液中的溶解氧含量。芽孢杆菌生长 曲线的测定则是接种1C芽孢悬液于50 mL LB液 体培养基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/min振 荡培养，每隔30min取3mL样品，用分光光度计测里-Lg00 nm o

1.6数据处理

采用SAS8. 0统计软件进行数据处理，采用 One-Way ANOVA程序对数据进行单因素方差分 析，Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值士标 准差表示，以P<0. 05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1芽孢杆菌的分离鉴定

本试验对15种商品来源的芽孢杆菌进行了分 子鉴定，并进行了序列比对，结果显示，商品中标识 的芽孢杆菌的菌株鉴定结果基本与实际鉴定结果一 致。药用来源的菌株与其对应的种属菌株同源性较 高且均保持一致；而饲用来源的9种样品中有3种 样品的菌株鉴定结果与标识结果有出人，如标记为 解淀粉芽孢杆菌鉴定为枯草芽孢杆菌（S8);标识为 凝结芽孢杆菌最终被鉴定为枯草芽孢杆菌（S13); 标识为枯草芽孢杆菌被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (S14)(表 1)。

2.2各菌株产酶能力比较

分离的15株芽孢杆菌均具有蛋白酶、淀粉酶、 纤维素酶的活力，但不同菌株之间水解酶的活力具 有较大差异。其中蛋白酶水解能力最强的3株菌依 次为S15、S11、S9，纤维素酶水解能力最强的3株菌 依次为S9、S8、Y2，淀粉酶活力最强的3株菌依次为 Y1、Y4、S9。综合分析，S9菌株表现出较高的综合酶 活，其蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶的活力在15株芽孢 杆菌中均具有较大优势(表2)。

样品来源 号 16SrDNA同源性 16S rDNA .homology/ %111111111111110010010099991001001009999999999100Sample source源首®美常安®益君康®思连康®画爽舒宝®京常乐®洚发酵饲料拿发酵饲料爾发酵饲料发酵豆粕发酵豆粕发酵饲料发酵饲料发酵饲料1100发酵豆粕录 o.k登N2n 8ank2nBo6nias8esB5GeJncecKaGs9nXi as株rtuse菌r de对ec rs比apullmiocCaBs.eplp称pSsmY s名a ussul株 felori ec菌anc iB识as ruftlo标lsi n品ckoraiaBt样acMifitnedi 果ra结lu .o定ce号lN鉴o编 1mY子 株niad分n菌rtaS其 n及oite源alcor来suio s离fo l分 astnli的ucsi菌edsree 杆ecMhr 孢Tu源os源芽1 来 n来 el株iar用bt表a菌S药T ..7242861885YJKK92L9FX ssiuleitrbecu ss sululillcicaaBBKJKYLS s isliutebruesc ssuulllliiccaaBB34YY ..8550200138UYKK792LPFI s sniemirc oa f feinueqihlcoill ysumlal iscuallBicaB9Lk CsJn esiicmarf oefuinqielholcyil msau lsluilcliacBaB67YSecruos deeF源来用饲 ..5855229083FUJK1-3kH2P Is nsieimcra o fe fiunqeilhocilly msual lisuclaliBcaB02-SB42 s nsieimcra o f feiunqeihlcoilly smuall iscualliBcaB90S1S ..170439784138RYKK8-NQ9C2 LsFi msirloit fibnues hscuilll isculaliBcaB23 3s3i msrn oafliungeahocc ils sululillcicaaBB23 1ISS .459801XKxZ76 sulimup sullicaB41K sulimup sullicaB5 IS1KY819008. MF373392KY8147. KY825126. KY819005. Bacillus subtilis FL102Bacillus coagulans MA-13Bacillus subtilis FL29Bacillus licheni formis 06Bacillus amylolique faciens FL97Y2Bacillus subtilis R-179Y5Bacillus coagulans SSBS8Bacillus amyloliquefaciens k-10SllBacillus lichenif ormis 30S14Bacillus subtilis K15期

表

杨坤明等：几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

2 15株芽孢杆菌产酶能力比较

Table 2 The results of enzymatic capacity comparison of 15 Bacillus spp. strains

菌株来源

菌株

水解圈直径

蛋白酶

Strain sources

药用来源

Strain No.Y1Y2T3Y)Y5Y6S7S8S9S10S11S12S13S1)S15

Medicinal source

饲用来源

Feedsource

Protease 16. 7±1. 219. 0±0. 713. 3±1. 81). )±1. 320. 3±1. 816. )±1. 21). 7±1. 619. 8±1. 821. )±1. 619. 7±0. 821. 8±1. 116. 1±0. 81). 7±0. 512. 7±1. 022. )±1. 2

Hydrolysis circle diameter/mm纤维素酶Cellulase淀粉酶Amylase18. 1±0. 836. 1±1. 622. 3±1. 129. 1±1. 317. 1±0. 822. )±0. 915. 7±0. 933. 0±1.)19. 1±0. 813. 1±0. 816. 8±1. 119. 8±1. 118. 7±0. 922. 3±1. 123. 1±0. 828. 8±1. 126. )±1. 231. 3±1. 115. 9±0. 822. 6±0. 818. 6±0. 820. 1±0. 817. 9±0. 619. 6±0. 813. )±0. 517. )±0. 513. 3±1. 115. 8±1. 111. 5±0. 615. 3±1. 1

2.3

各菌株抗菌活性比较由表

3

可知，所有的芽孢杆菌对金黄色葡萄球

Y2、Y6、S7、S9、S10、S11、S12菌株可对大肠杆菌产

生抑制作用。其中，S9菌株对指示菌表现出的抗菌

活性最强。

菌及藤黄微球菌均产生显著的抑制活性，但只有表

3 15株芽孢杆菌抗菌活性比较

Table 3 The results of antimicrobial activities comparison of 15 Bacillus spp. strains

菌株

抑菌圈直径 Diameter of antibacterial circle/mm

源

菌株

金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus Strain sources

药用来源

Strain No.Y1

Y2Y3Y)Y5Y6S7S8S9S10S11S12S13S1)S15

藤黄微球菌Micrococcus luteus大肠杆菌Escherichia coliMedicinal source

饲用来源

Feedsource

18. 3±0.)15. 6±0. 813. 2±0. 220. 2±0. 915. 9±0. 612. 3±0.)18. 8±1. 112. 2±0. 92) 3±1. 116. 9±0. 618. 9±1. 611. 3±0.)10. 2±0. 29. 2±0. 21). 3±1. 123. 5±0. 716. 3±0.)1). 9±0. 622. 3±1. 118. 9±0. 616. 1±0. 822. 5±0. 712. 8±0.)27. 8±1. 117. 9±0. 620. 6±0. 815. 7±0. 919. 3±0.)20. 6±0. 819. )±0. 6-16. )±0. 6---13. 9±0. 812. 3±0.)-19. 0±0. 711. 8±0.)1). 1±0. 88. 9±0. 6---

1246

中国畜牧兽医

45卷

2.4各菌株耐酸性比较

本试验检测了芽孢杆菌营养体在pH为2.0和 3.0环境下培养3h的存活情况，结果见表4。由表

4可知，在pH为3.0时，所有菌株营养体细胞存活

39、38、¥2，其中39菌株的存活率达到了92.0%。

在pH为2. 0时，各菌株营养体 降低，与

pH 3. 0时相似，S9、S8、Y2菌株的营养体细胞存活

对较高。

率均

表

50%，其中 最高的3株菌株依次为

4 15株芽孢杆菌菌株营养体细胞对低pH的耐受性

Table 4 The tolerance of vegetative cells of 15 Bacillus spp. strains to low pH

菌株来源

菌株

存活率 Survival rate/ %

Strain sources

药用来源

Strain No.

Y1Y2Y3Y4Y5YS7

6

pH 3. 52'885'977'860'562'772'478'187'592'058'179'869'267'353'673'8

0

pH 2.

22.1

0

Medicinal source

71.060.537.441.046.6.2

68.8

词用来源Feed source

SS9

8

S10S11SI 2S13S14S15

85.5.165.8.840.925.755.7

2.5各菌株胆盐耐受能力比较

在0. 3%牛胆盐环境下，经12h培养后各菌株

图1。由图1可知，各菌株在0. 3%

盐环境下培养12 h后存活率均超过50%。Y2、Y3、

Y5、S7、S9、S11、S14菌株存活率较高，其中菌株Y2和S9存活率超过90%，对胆盐耐受性最好。

1 15株芽孢杆菌菌株对0.3%牛胆盐耐受性

Fig. 1 The tolerance of 15 Bacillus spp. strains to 0. 3% bovine bile salt

图

2.6各菌株抗菌药敏感性比较

15株芽孢杆菌对11种常

霉素的耐药性，如Y4、S10菌株对四环素耐药，Y4、

菌药敏感性结果 出对四环素和红

Y5、Y6、S10、S12、S13菌株对红霉素耐药，Y1菌株

见表5。由表5可知，分离出的菌株对大多数抗菌 药

出敏感性，但

菌株

对氨苄西林耐药。

£霉素链霉素氨苄西林 sssss+ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +ssS+SSSSSSSSS+ +s+s+s+sS+ +S+ +amycinStreptomycinAmpicilinRSs+ss+ssS+ +S+ +s+s+s+s+S+ +S+ +3-鵁荦濟象#一羊澍迪_旰喵菡苹_«商圈直径为0〜6 mm6 to 25 mm；S,Low sensitivity and1247

那n卡aKn素ici霉maStm大nem庆G/elcrincic l星aaxi沙roSelft氟rcoa诺bNitna fno星i crae沙xtSeolm氟fa氧OiD 径nit直ec圈素ym+菌霉oSr抑氯olhCni素co霉r+htS.yp红rpEs sull niic星caaB 沙xol+ni丙foS yt环rpiivCitisneesn ilai素lcre环ycStca四artbe较itT比na 性fo 号感no编ni.ao1敏sir株rtNY药a菌S菌pm抗oc 对eh株T菌 源源5 e来ne来lb株icarru用表aT菌toSs药+ss+ssSSsssR+ssSR34YYss++ ++SS+s +SssR+S++ s+SSs67YS源来用饲SS++ss++ ++SS++ ++SS+ ++sSsR+ +sS+sR90S1SSS++ s+S++ ++SS++ ++SS+ ++sSRR+s +Ss+s23 1ISSS菌1 s，抑aw感 rete+敏 m+，不aiSRd ;lmaimbo r6c1im+〜it 6n+aS为 径eht直 d圈na,菌yti+v i+，抑tmiS感smn 敏e6s 度 oett a0，低r esda+S ow ;+mM r,eSm t +e52S；mai〜md6 1mla i为5b2o rs径nc直aihtmi圈 tren菌ga rae，抑lh ts adn+感w ar+敏?eetS度evit，中miasin+de lsSan iI;b,moRmr：cis m5m2imt于n 6a1大 e o径htt 6直d nsa5a ,I圈ewS菌v riteit，抑sen感emsai敏 yd ll度hagiib，高Hor ,c i++ mi++tnSSa5sS+ +s+s+S+ +S+ +S+ +S+ +S+ +s+s+ss+S+ +s+S+ +S+ +RssSSSsSS+SMedicinal source Y2SsY5Ss+Feed sourceS8ss+SllssS14s+S+ +1248

中国畜牧兽医

45卷

2B

优良菌株生长与耗氧速率的比较

综合以上试验结果可知，Y2、S9菌株在代谢

面

测

出 耗氧

速率与生长速率。由图2可知，S9、Y2菌株分别在24°、27°min将溶液中的氧气消耗完全，且S9菌株生长速率高于Y2菌株。

力、抑菌力、耐受性及抗菌药敏感性

，因此选取Y2与S9菌株

8

76321

(HJ/bom)/uo1:coqu.odmoCL)nuboxxo

0 30 60 90

150 180 210

取样时间 Sampling time/h

120 240 270 300

2优势菌株生长曲线与耗氧曲线

Fig. 2 The curves of growth and oxygen consumption of dominant stains

图

3讨论

3.1芽孢杆菌的分离鉴定

生态制剂的使 菌种的好坏有着直接的关系，研究 并非所有的芽孢都具有同等的稳定性，而 同芽孢杆菌的抗菌和代il同[15]。益生菌主要考察菌种的安全性（ 性、肠道中 及定植 [16]。本试验 15具有 芽孢杆菌种属 的微生态商品，其中6种药用菌株 规范，产品中菌株组成和含量标

晰，从分离菌株16SrDNA的初 定 ^来， 的芽孢杆菌种属 测的 致。本试验 的9 样品只对其芽孢杆菌类型做

单

和说明，其来源大多无从考证，这

：饲

芽孢杆菌的使用属性有一定关系，作为生物饲料 使，更加注重的是产品的 。从鉴定，6种药用样品的芽孢杆菌种属 H只

致，S8和S14样品中枯草芽孢杆菌和解淀粉 芽孢杆菌 孢杆菌，而

，而S13样品中 定出的

的是凝结芽

草芽孢杆菌，在

定是芽孢杆菌的纯培养物，在样品收集和分离过程

中存在 的 ，也会导致鉴定 的差异。3.2 杆菌的代谢特性芽孢杆菌具有 的代谢酶活力，在体内代谢产生的消化酶类 进机体对营养物质的吸收，高营养物质的转化率。Jadamus等[18]研究 丨，芽孢杆菌 高 空肠中 酶的活性，降低空肠食糜中细菌产生的 解聚酶的活性，从 而 进 的 消化 吸 。 从本 试验 离 的 芽孢 杆酶 的 ，5株菌株均可在生长代

中 酶、纤维素酶、淀粉酶。其中Y1、

T4菌株为蜡样芽孢杆菌，产淀粉酶 于其他菌株，这

较强的

[19]试验中蜡样芽孢杆菌产淀粉酶

致。Y2、Y3、S8菌株为枯草

菌

芽孢杆菌，其产酶 为淀粉酶> 纤维素酶> 丨

酶，这 [2°]所测枯草芽孢杆菌 淀粉酶

于 他 酶 类 的 。 [21] 研 究发现解淀粉芽孢杆菌 草芽孢杆菌的产酶能力相当，而本试验中解淀粉芽孢杆菌S7、S14、S9的产酶 能力与Y2、Y3、S8菌株相近。这可能是由于解淀粉 芽孢 杆菌

草 芽 孢 杆 菌

性 较 高 !从 而 生 理

生化特性亦具有相似性。

益生菌产抗菌物质的能力也是益生菌筛选的关 键之一[3]。从本试验分离的15株芽孢杆菌抗菌活 性来看，大部分菌株都具有广谱的抑菌作用，7株芽 孢杆菌

出对革兰氏阴性致病性大肠杆菌的抑制

Hoa

[17]报道中也出 属标记 定 致

的 。出现这 的原因 面 有的试验鉴定 16SrDNA的特异性序列，而芽孢杆菌不同种属之间16SrDNA序列的差别不大，最 的鉴定

’•另

要结合生理生化、G + C 面，，

进

源的芽抱杆囷样品不一^

5期杨坤明等：几种商用益生芽孢杆菌特性的比较研究

1249

活性，其中5株是饲用样品来源。从本试验结果来 看，大部分饲用来源的芽孢杆菌经过了广谱的抗菌

选育，尤其是S9菌株的综合抗菌能力最强。进一步 比较了性能较好的Y2和S9芽孢杆菌的生长耗氧 情况发现，S9菌株生长代谢更旺盛，耗氧速率更快。 3.3芽孢杆菌营养体细胞的稳定性

芽孢对酸性的忍受力很强，绝大数菌株的芽孢 经过3h的酸处理仍然保持了较高的活菌数[16’22]。 考虑到芽孢受到酸活化导致芽孢萌芽产生营养体， 参考文献(References):

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而芽孢杆菌的营养体对酸性环境非常敏感，易被低 酸胃液致死[1(]，所以本试验检测的是芽孢杆菌营养 体的稳定性。从结果来看，营养体细胞在低酸环境 中存活率均有所降低，而且这15株菌株的耐受能力 也各不相同，但部分菌株仍表现出较高的存活率 (S9、S8和Y2#芽孢可能会在动物的空肠和回肠 中增殖，这就要求芽孢能够抵制小肠液中的胆盐和 胰液素的毒害作用[&。本试验中，〇. 3%胆盐对不 同芽孢杆菌的生长均具有一定的延滞作用，而且不 同菌株对胆盐的耐受性各不相同，仅有Y2和S9的 存活率达到了 90%以上。因此，从芽孢杆菌低酸和 高胆盐耐受稳定性结果来看，各菌株差异较大，为了 保证芽孢体内萌发进人到胃肠道中仍能保持足够的 细胞活力，相关的稳定性筛选试验是非常必要的。 3.4芽孢杆菌抗菌药敏感性

在抗菌药的选择性压力下，细菌间耐药性基因 的传递和转移会导致严重的抗生素耐药问题。作为 活菌制剂的益生芽孢杆菌，使用的范围广，扩散面 大，所以选择菌种的时应谨慎，对于携带有可转移耐 药性基因的细菌，在生产实际中不得采用）3]。由本 试验结果来看，饲用源的芽孢杆菌中，S10、S12、S13 菌株均表现出对红霉素的耐受，同时S10菌株还对 四环素耐受，与Hoa等[1/研究结果一致。这种情 况应在菌株选育和扩大生产时引以注意，尤其是在 筛选阶段需要重点关注。4

结论

本试验收集整理了 15种药用和饲用的益生芽 孢杆菌产品，并对其芽孢杆菌进行了分离鉴定及益 生特性比较，结果显示分离的饲用芽孢杆菌存在标 识菌株与实际鉴定结果不一致的问题，各芽孢杆菌 在代谢酶活力、抗菌活性方面有较大差异，芽孢杆菌 营养体细胞的抗逆特性也各不相同；少量菌株表现 出了抗生素的耐药性。在这15株芽孢杆菌中，S9 解淀粉芽孢杆菌具有更优良的益生特性。

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(责任编辑姚倩倩）