家蚕MLP基因的克隆及其结构分析

研究报告 DOI: 10.1360/yc-007-1097

家蚕MLP基因的克隆及其结构分析

刘岩, 牛宝龙, 翁宏飚, 沈卫锋, 何丽华, 齐晓朋, 孟智启

浙江省农业科学院蚕桑研究所, 杭州 310021

摘要: 利用生物信息学的方法快速获得家蚕MLP (Muscle LIM protein, MLP)基因cDNA电子序列, 经RT-PCR生物验证正确, 登录GenBank (No. DQ311195)。MLP基因cDNA长2 327 bp, ORF全长1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。该MLP基因组DNA含有11个外显子, 10个内含子, 所有内含子/外显子边界都符合典型的GT/AG剪切模式。MLP基因编码的蛋白富含Gly (14.4%), 分子量约为53.03 kDa, 等电点(PI)为8.29。通过BLAST分析发现该基因编码的家蚕肌肉LIM蛋白, 含有5个保守的LIM结构域, 家蚕的另一种LIM蛋白(AAR23823)含一个LIM结构域, 两者可能是通过可变剪切产生; 后者可能通过竞争作用调节前者在肌细胞中的功能。MLP的克隆为进一步研究其体内功能奠定了基础。 关键词: 家蚕; MLP; 表达序列标签(EST); LIM结构域

Cloning and structural analysis of MLP in the silkworm, Bombyx mori

LIU Yan, NIU Bao-Long, WENG Hong-Biao, SHEN Wei-Feng, HE Li-Hua, QI Xiao-Peng, MENG Zhi-Qi

Sericulture Research Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China

Abstract: The LIM domain is found in a wide variety of eukaryotic proteins that regulate gene expression and cell differ-entiation during development. Muscle LIM protein (MLP) gene in Bombyx mori has been cloned by blasting its EST data-base and PCR test in present report. The resulting sequence covers 2 327 bp of cDNA (GenBank accession No. DQ311195). It has a complete open reading fragment and encodes a 494 amino acid protein. Genomic DNA sequence contains 11 exons and 10 introns, with intron splicing following the GT-AG rule. M.W. and PI of the predicted MLP in Bombyx mori are 53.03 kDa and 8.29 respectively. A single LIM domain linked to a glyscine-rich region is found in a previously deposited LIM protein (AAR23823) in Bombyx mori. MLP identified in this report encodes a protein with five tandem LIM-glycine modules. The two LIM proteins could be produced by alternative splicing and both are probably involved in muscle cell differentiation. This work provides foundation for further research on the in vivo function of MLP.

Keywords: Bombyx mori; MLP; expression sequence tag (EST); LIM domain

LIM是3种转录因子线虫Lin-11、鼠Isl-1和线虫Mec-3名称首字母的缩写[1,2]。LIM家族蛋白都含有一个或多个保守的LIM结构域。LIM结构域是由一段

富含半胱氨酸的(CX2CX16-23HX2CX2CX2C- X16-23CX2-3(C/H/D))序列组成[3,4], 其中保守的半胱氨酸、组氨酸及天冬氨酸残基形成具有Zn2＋结合

收稿日期: 2007−02−09; 修回日期: 2007−03−13

基金项目: 国家自然科学基金项目(编号：30371087)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目资助(编号：2006AA10A119) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30371087) and the National Hi-Tech Research and Development Program (863) of China (No. 2006AA10A119)]

作者简介: 刘岩(1976−), 女, 河南温县人, 助研, 博士, 研究方向：昆虫分子生物学。E-mail: mayanly@sina.com 通讯作者: 孟智启(1953−), 男, 浙江杭州人, 研究员, 研究方向：昆虫分子生物学。E-mail: mengzq2001@sina.com

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第29卷

口袋的稳定的三级结构[4~7]。借此结构域, LIM蛋白参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 调节胚胎发育、细胞分化和细胞骨架形成等。LIM家族蛋白可以分为两大类: 一种是与功能结构域相关的LIM蛋白, 包括LIM同型域蛋白(LIM homeodomain, LIM-HD)和LIM激酶(LIM kinase, LIM-K); 另一类就是只含有LIM结构域的蛋白质(LIM only protein, LIMO)。

CRP家族蛋白有两种形式的LIM结构域, 每个都含一富含甘氨酸的LIM区域[8,9], CRP家族蛋白参与脊椎动物肌肉细胞分化。MLP(muscle LIM protein)属富含半胱氨酸蛋白(cysteine rich protein, CRP)家Stronach等[11]在果蝇中鉴定族, 参与肌肉的分化[10]。

出两种MLP蛋白, Mlp60A蛋白含一个富含甘氨酸的LIM结构域, Mlp84B蛋白含有5个富含甘氨酸的LIM模块。Hwang等[12]克隆到一种长622 bp的家蚕LIM同源蛋白的cDNA, 它编码产生94个氨基酸的家蚕LIM同源蛋白, 该蛋白含有1个甘氨酸丰富的LIM结构域。除此之外, 人们对家蚕LIM相关基因的了解仍很有限。为探究家蚕基因组是否含有5个LIM结构域模块的Muscle LIM protein, 本文以果蝇的MLP基因序列为信息模板, 对家蚕EST库进行同源比对, 经过反复的延伸和比对, 获得了家蚕MLP基因的全长cDNA序列; 经生物验证并对MLP基因结构进行了分析。

1.2 供试材料蚕

由浙江省农科院蚕桑所蚕种室提供, 品种为P50。

1.3 MLP基因的快速电子拼接电子克隆

根据物种间同源基因的核酸序列相对保守并有一定同源性的特点, 以果蝇Mlp84B同源基因的cDNA序列为模板, 用BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/)程序检索GenBank中的家蚕EST公共序列, 把检出序列拼接成contig后, 以此contig为被检序列再次进行Blast, 重复上述操作, 直至所有检出的重叠EST或连续体序列不能继续延伸

[13,14]

。最后对获得的电子克隆基因(家蚕MLP)的特性

进行初步分析。

1.4 MLP拼接基因的生物验证 1.4.1 引物设计

根据电子克隆所得的家蚕MLP基因序列, 利用Primer premier(version 5.0)软件设计引物P1~P4 (表1), 其中引物P1/P2用于扩增和P3/P4引物对分别用于扩增MLP基因的上段和下段。 1.4.2 家蚕组织总RNA的抽提

取蚕蛹(P50)数只, 置入研钵内; 迅速加入液氮并研成粉末, 然后加入1 mL Trizol, 用研钵棒混匀后移入1.5 mL离心管中; 4℃, 12 000×g离心5 min, 将上清移入一新的1.5 mL离心管中; 加入200 µL氯仿, 涡旋器上振荡混匀30 s, 室温放置2～3 min, 4℃, 12 000×g离心15 min; 将上清移至一新的1.5 mL离心管中, 加入0. 0.5 mL异丙醇, 室温放置10 min, 4℃, 12 000×g离心10 min; 移去上清液后加入1 mL 75％乙醇, 涡旋器上振荡后4℃, 7 500×g离心5 min后, 弃去上清; 待稍干后, 加入适量RNase- free HB2O溶解备用。

1.4.3 RT-PCR扩增家蚕MLP基因

RT参照Fermentas公司试剂操作说明书步骤进行。

1 材料和方法

1.1 试剂与菌种

DNA连接试剂盒购自TaKaRa(大连)公司; 质粒提取和胶回收试剂盒购自上海鼎国公司; RNA提取试剂盒购自V-gene; DNA Marker、Taq DNA Ploymerase、dNTP Mix购自TaKaRa(大连) 公司; RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase和RNase抑制剂购自Fermentas公司; 宿主菌E. coli TG1由本实验室保存。

表1 实验所用引物

Table 1 Primers used for PCR

引物名称 Primer

引物序列 Sequences(5′→3′)

引物长度

Length of rimer (bp)

24 25 25 20

产物名称

Product

产物大小

Length of product (bp)

P1 CAATGCCTTTCAAACCCGCTGATA P2 GCAGTATCAATCACGGTGGTCTTAG P3 CTAAGACCACCGTGATTGATACTGC P4

AAACTAAGGGCCCAGACACA

MLP-up 628

MLP-down 1,1

第9期

刘岩等: 家蚕MLP基因的克隆及其结构分析 1099 以实验家蚕的cDNA为模板, 用设计的引物扩增特异性片段。PCR反应程序为: 94℃预变性5 min, 然后94℃变性60 s, 56℃复性60 s, 72℃延伸90 s共30个循环, 最后72℃延伸10 min。 1.4.4 构建pMD18-MLP克隆并测序

上述PCR产物经电泳后, 割胶回收对应的产物, 与pMD18-T以适当的比例连接, 转化E. coli TG1感受态细胞, 然后筛选鉴定阳性克隆, 送交英俊生物技术有限公司测序。

1.5 MLP基因的生物信息学分析 1.5.1 核酸序列分析

将MLP基因cDNA序列提交NCBI数据库, 与家蚕的全基因组序列进行BLAST比对, 利用http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php 平台拼出MLP的DNA序列。利用http://pbil.univ-lyon1.fr /sim4.php及http://genes.mit.edu/genscan.html分析基因。 1.5.2 氨基酸序列分析

(1)通过软件GenScan(http://genes.mit.edu/ genscan.html)及DNAman软件推导出MLP cDNA编码产生的氨基酸序列, 并利用Protean软件分析MLP蛋白的基本特性。

(2)将MLP蛋白序列提交Blast(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/), 分析蛋白的保守结构域。

2 结果与分析

2.1 MLP基因在家蚕EST库的检索

从NCBI的EST数据库中选取果蝇的Mlp84B的cDNA(X91245), 在http://www.ncbi.nlm.nih. gov/BLAST/ 站点对家蚕EST数据库的BLAST检索, 将与X91245有部分同源的EST序列拼接成连接体, 用连接体反复进行家蚕EST数据库的BLAST检索、拼接, 最终获得2 327 bp的家蚕MLP基因cDNA全序列(图1)。该序列受EST完全支持, 有完整开放式阅读框(ORF)大小为1 485 bp, 编码产生494个氨基酸。

图1 组成MLP全长cDNA的家蚕EST片段

Fig. 1 EST clones used to construct the full length cDNA of MLP

2.2 生物验证电子克隆基因

提取蚕蛹总RNA, 经RT后用特异性引物对分别进行扩增。1％的琼脂糖凝胶电泳分析时出现预期大小的条带(图2)。回收各目的条带, 与pMD18-T连接构建pMD18-MLP-up、pMD18-MLP-down重组体, 筛选阳性克隆测序。结果显示: 家蚕MLP扩增区间内的核苷酸与预计的MLP电子克隆序列相同。将完整的MLP基因cDNA序列登录GenBank, 登录号为: DQ311195。

图2 RT-PCR扩增家蚕MLP基因cDNA

1: DNA 标准分子量DL2000; 2: MLP-up的RT-PCR产物; 3: MLP-down的RT-PCR产物。

Fig. 2 Identification of the MLP cDNA from Bombyx mori

1: DL2000 DNA ladder marker; 2: RT-PCR products of MLP-UP segment (about 628 bp); 3: RT-PCR products of MLP-Down seg-ment (about 1 1 bp).

2.3 MLP的基因组DNA分析

MLP的cDNA序列与家蚕的基因组contig序列进行Blast比对, 利用http://pbil.univ-lyon1. fr/cap3.php将检出序列拼接得到家蚕MLP基因组DNA序列。利用http://genes.mit.edu/genscan.html和http://pbil.univ-lyon1.fr/sim4.php分析该MLP的基因组DNA的结构, 包含11个外显子, 10个内含子(图4), 所有外显子与内含子的边界都符合典型的GT/AG剪切模式。与家蚕已经报道的622 bp长度LIM protein homologue gene的mRNA(AY461436)比较发现, 两种基因编码的氨基酸起始于同一位置终止不同位置(图4), 这种相近的结构可能与MLP在肌细胞中功能的行使相关[11]。产生这种现象可能与基因的选择性剪切有关。

2.4 MLP编码氨基酸序列分析 2.4.1 MLP蛋白基本特性分析

利用Protean软件分析MLP基因编码的494个氨

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第29卷

图3 家蚕MLP基因的cDNA及氨基酸序列

图中加粗斜体碱基处分别对应4条引物位置, 其中P1和P2引物扩增MLP-up, P3和P4引物扩增MLP-down。氨基酸LIM结构域用阴影表示; 其中圆圈标注LIM结构域中保守的半胱氨酸和组氨酸, 方框标注了富含的甘氨酸残基区域, 下划线处标注为推测的LIM结构域核酸靶信号碱基。

Fig. 3 Nucleotide and derived amino acid sequence of Bombyx mori MLP, a five LIM domain protein

Amino acid positions are indicated by numbers in the left margin preceding each row. Four primers are shown in italic and bold, which were used to amplify MLP-up and MLP-down respectively. Five conserved LIM domains in MLP are shown in shadow. The conserved cysteine and histidine residues of the five LIM domains are circled. Glycine residues that comprise the glycine-rich regions following each LIM do-main are boxed Putative nuclear targeting signals found adjacent to the LIM domains are underlined.

第9期

刘岩等: 家蚕MLP基因的克隆及其结构分析 1101

图4 家蚕MLP基因的结构示意图

Fig. 4 Schematic structure of MLP gene in B. mori

基酸, 出现频率最高的3种氨基酸分别是: Gly(14.4%)、Lys(9.1%)和Cys(8.7%)。碱性氨基酸66个(13.36%), 占总分子量的17.06%; 酸性氨基酸48个(9.72%), 占总分子量的比重为11.05%; 疏水性氨基酸有119个(24.09%), 占总分子量的23.80%。MLP蛋白分子量约为53.03 kDa, 1微克相当于18.857 pmol。等电点(PI)为8.29, pH 7时荷电量为18.93。 2.4.2 MLP的保守结构域分析

家蚕MLP的保守结构域分析发现: MLP分子中存在5个富含甘氨酸的LIM结构域(CX2CX16- 23HX2CX2CX2CX16-23CX2-3(C/H/D))(图5)。每个LIM结构域中保守的半胱氨酸和组氨酸标注如图3所示。LIM protein homologue gene编码的蛋白(AAR23823)含有一个LIM结构域(图5)。

比对, 经过反复的延伸和比对, 快速获得家蚕MLP基因的全长cDNA序列, 经RT-PCR生物验证电子拼接正确。本研究表明利用生物信息学的方法进行电子克隆是挖掘新基因的一种行之有效的技术手段。

CRP与actin细胞骨架蛋白相关, 并能直接与其他LIM蛋白结合, 这对于细胞粘附及受体整合具有重要的信号调节作用[3,9]。CRP家族蛋白富含甘氨酸, 这也是CRP区别于其他LIM only类蛋白的一个明显特征。Stronach等[11]鉴定出两种果蝇的CRP家族蛋白, 其中果蝇Mlp60A有一个富含甘氨酸的LIM结构域, 而Mlp84B有5个完整的富含甘氨酸LIM结构域。本研究首次证实家蚕中也存在类似的情况; 基因结构分析表明家蚕MLP含有5个保守LIM结构域: (CX2CX16-23HX2CX2CX2CX16- 23CX2-3(C/H/D))。LIM结构域富含甘氨酸并基本符合GPKG(F/Y)G(F/Y)GXGAG规律, 核酸结合信号区与(K/R)G(F/Y)(G/A)FVX(F/Y) [18]规律吻合(图3)。Hwang等[12]从卵期组织cDNA文库中克隆到家蚕LIM protein homologue基因, 该基因编码蛋白含有一个甘氨酸含量丰富的LIM结构域。这两种家蚕LIM蛋白基因前3个外显子重叠, 从第四个外显子处出现不同(图4), 这可能是由基因可变剪切产生的; 这与果蝇发现的两种CRP蛋白(Mlp60A和Mlp84B)间的关系不同。Hwang等[12]研究认为mRNA可以上调晚期胚胎的发育。本研究从蛹组织克隆到家蚕MLP基因, 说明在幼虫向成虫转换阶段, 昆虫形态及组织学发生变化, 这个阶段需要MLP的参与介导分化。

含5个LIM结构域的果蝇Mlp84B在信号复合体和/或结构复合体的形成中起到脚手架功能, 单LIM结构域的果蝇Mlp60A蛋白对Mlp84B起到竞争抑制

图5 MLP的LIM保守结构域分析

Fig. 5 Analyses of conserved LIM domain in Bombyx mori MLP

3 讨 论

影响生物体基础生命活动的关键基因在不同物种间具有很高的保守性, 正是基于这一点, 近年来出现了利用生物信息学方法来快速克隆基因的方法[15]。这种方法具有快速、高效和针对性强等优点, 越来越多地被用于克隆与源基因物种亲缘相近的物种新基因。我们实验室曾利用该技术曾先后克隆到家蚕Tpi、6PGDH等基因[16,17]。本研究中, 我们利用果蝇MLP基因序列为信息模板, 对家蚕EST库进行同源

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的调节作用[11]。家蚕中发现的家蚕的MLP是否也在肌细胞中起到脚手架功能？单LIM结构域的家蚕CRP是否是作为竞争体参与功能发挥的调节？这两种基因的表达和分布特点又如何？这些仍有待于进一步的研究阐述。总的来说, 家蚕MLP影响肌细胞的分布、调节基因表达, 本研究成功克隆并分析家蚕MLP基因, 这对下一步开展家蚕的生长等方面的研究奠定了基础。

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