Fluorcam多光谱荧光成像技术及其应用

自上世纪90s年代PSI公司首席科学家Nedbal教授与公司总裁Trtilek博士等首次将PAM脉冲调制叶绿素荧光技术与CCD技术结合在一起，成功研制生产FluorCam叶绿素荧光成像系统（Nedbal等，2000）以来，FluorCam叶绿素荧光成像技术得到长足发展和广泛应用，先后有封闭式、开放式（包括标准版和大型版）、便携式叶绿素荧光成像系统，及显微叶绿素荧光成像系统、大型叶绿素荧光成像平台（包括移动式、样带式、XYZ三维扫描式等）等，近些年还进一步发展了PlantScreen植物表型成像分析平台（Phenotyping）（有传送带版、XYZ三维扫描版及野外版等）及多光谱荧光成像技术。

Multi-color FluorCam多光谱荧光成像技术包括多激发光－多光谱荧光成像技术和UV紫外光激发多光谱荧光成像技术：

1. 多激发光－多光谱荧光成像技术：通过光学滤波器技术，仅使特定波长的光（激发光）

到达样品以激发荧光，同时仅使特定波长的激发荧光到达检测器。不同的荧光发色团（如叶绿素或GFP绿色荧光蛋白等）对不同波长的激发光“敏感”并吸收后激发出不同波长的荧光，根据此原理可以选配2个或2个以上的激发光源、绿波轮及相应滤波器，对不同波长荧光（多光谱荧光）进行成像分析。如FluorCam便携式GFP/Chl.荧光成像仪及FluorCam封闭式GFP／Chl.荧光成像系统具备红光和兰光及相应滤波器，可以对GFP和叶绿素荧光成像分析；FluorCam开放式多光谱荧光成像系统可以进一步选配不同颜色的激发光，如除红光、蓝光外，还可选配绿色光源及相应滤波器，以对YFP进行荧光成像分析等；

2. UV紫外光激发多光谱荧光成像技术：长波段UV紫外光（320nm－400nm）对植物叶片

激发，可以产生具有4个特征性波峰的荧光光谱，4个波峰的波长为兰光440nm（F440）、绿光520nm（F520）、红光690nm（F690）和远红外740nm（F740），其中F440和F520统称为BGF，由表皮及叶肉细胞壁和叶脉发出，F690和F740为叶绿素荧光Chl-F。紫外光激发多光谱荧光（UV-MCF）可以用来灵敏、特异性地评估植物生理状态包括受胁迫状态，包括干旱、病虫害、环境污染、氮胁迫等

本文就FluorCam多光谱荧光成像技术产品及最新应用案例做一简单介绍，其中FluorCam便携式GFP/Chl荧光成像仪（Handy GFPCam）和FluorCam封闭式GFP/Chl荧光成像系统（Closed GFPCam）已有较为详细的资料介绍，在此不再专门介绍。

一、FluorCam多光谱荧光成像系统（一体式）

FluorCam多光谱荧光成像系统（一体式）具备三种激发光：红光、蓝光和紫外光，同时内置7位滤波轮和相应光学滤波器，不仅可以进行一般的叶绿素荧光成像分析，还可进行GFP绿色荧光蛋白（选配）及UV-MCF荧光成像分析——包括F440、F520、F690和F740多光谱荧光成像分析，并且可以选配QA再氧化与OJIP成像分析模块，成像面积13x13cm，FluorCam 7.0可以运行和分析Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭分析、光响应曲线、MCF等自动实验程序（Protocols）并可自定义自编程实验程序。

下图为植物接种病毒（PMMoV-I为意大利菌株，PMMoV-S为西班牙菌株）后（dpi为接种后的侵染天数）的UV-MCF多光谱荧光成像，其中Abaxial为叶片背面成像，Adaxial为叶片正面成像（引自Monica Pineda等，2008）

二、FluorCam多光谱荧光成像系统（模块式）

FluorCam多光谱荧光成像系统（模块式）为模块式组合，具备多功能、高灵活性和高度扩展性能。多激发光源，除红光、蓝光、紫外光源外，还可选配绿色光源、青色光源及白色光源等各种LED激发光源，同时具备7位滤波轮和相应滤波器组合，可对常规叶绿素荧光和UV-MCF进行成像分析，还可对其它荧光如GFP、YFP等进行荧光成像分析研究，并且可以选配PAR吸收／NDVI成像分析模块，成像面积有13x13cm（标准版）和20x20cm大型版供选配。不同荧光类型激发光光源及滤波器选择可参考下表（表中未包括UV-MCF），具体请咨询易科泰EcoLab实验室（eco-lab@eco-tech.com.cn或info@eco-lab.cn）

三、FKM多光谱荧光动态显微成像与光谱分析系统

FKM多光谱荧光动态显微成像系统是目前世界上功能最为强大全面的多光谱荧光成像系统，系统不仅具备多激发光、可以对多种不同波长的荧光进行显微成像分析包括叶绿素荧光动态显微成像分析，还集成了同步化高分辨率光谱仪、高时间分辨率双调制FL3500叶绿素荧光仪，对多光谱荧光进行超高光谱解析度、超高时间分辨率（微秒级）成像分析，曝光时间10 µs 至20 ms。光源包括白色、UV、蓝色、绿色、红色、红外光，通过激发光光学过滤器、分光镜和荧光发射过滤器组合，还可以对白光分色选取不同波长的激发光。自动或客户自定义测量程序（Protocols）包括Fv/Fm、Kautsky诱导效应、叶绿素荧光淬灭分析、光响应曲线分析、静态荧光、UV-MCF（须选配相应滤波器系统）、OJIP-test、QA再氧化动力学、光谱吸收动力学等。

蓝藻不同类型藻胆蛋白吸收光谱及荧光光谱（引自Kupper等，2009）

近期应用案例：

案例1：Alberto de Marcos等在2015年《Frontiers in Plant Science》上发表了题为

“Transcriptional profiles of Arabidopsis stomataless mutants reveal developmental and physiological features of life in the absence of stomata”的研究论文，研究通过FluorCam多光谱荧光成像技术，利用叶绿素荧光成像参数反映植物（拟南芥）的光合特性，研究

表明缺失气孔的拟南芥仍然可以进行一定的光合作用；利用多光谱荧光参数反映植物的次级代谢，发现无气孔变异株的蓝色荧光与绿色荧光增大，这种增大是对次级代谢产物类胡萝卜素、花色素等增大的响应。

案例2：Maria Luisa Perez-Bueno等利用FluorCam多光谱荧光成像系统扩展版，对菜豆（Phaseolus vulgaris）感染病原菌（Pseudomonas syringae）后的初级和次级代谢时空动态进行了研究分析（Spatial and temporal dynamics of primary and secondary metabolism in

Phaseolus vulgaris challenged by Pseudomonas syringae. Physiologia Plantarium, 2015）。初级代谢时空动态通过CO2固定率（光合作用）和叶绿素荧光参数Fv/Fm及NPQ等反映，而次级代谢则通过多光谱荧光得以反映，通过多光谱荧光特别是F440、F520、F680及其比率F440/F680、F520/F680，可以分析植物次级代谢产物酚类化合物的积累过程。

病原菌感染菜豆叶片后对光合作用的影响，ΦPSII、Fv/Fm、NPQ分别为叶绿素荧光参数有效光量

子产量、最大光量子产量及及非光化荧光淬灭指数，dpi为不同的感染天数

病原菌感染菜豆叶片后对次级代谢的影响，F440、F520、F680为多光谱荧光蓝色荧光、绿色荧光

及红色荧光

案例3：Espen Granum等利用FluorCam多光谱荧光成像系统扩展版，对鳄梨感染白纹羽病

后的代谢响应进行了研究（Metabolic responses of avocado plants to stress induced by

Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur. J. Plant Pathol. 2015）。研究结果表明，FluorCam多光谱荧光成像参数甚至可以在症状出现前就检测到感染，从而可以作为植物生物胁迫和非生物胁迫的早期诊断指标。

左图：感染25天和28天后的叶绿素荧光成像指标变化；右图：感染25天和28天后的多光谱荧光

成像指标变化

案例4：Miguel Costa Leal等利用FluorCam多光谱荧光成像系统，对珊瑚与共生藻类的关系进行了研究（Concurrent imaging of chlorophyll fluorescence, Chlorophyll a content and green fluorescent proteins-like proteins of symbiotic cnidarians），文章发表在2014年Marine Ecology。系统配置：包括红色、黄色及UV三种激发光源，高灵敏度CCD镜头，滤波轮及相应滤波器等

钮扣珊瑚虫收缩－膨胀不同时相（T1=0分，T2=30分，T3=60分）NDVI与GFP成像分析