BCA-TCA法快速测定烟草蛋白质的研究

Journal of Henan Agricultural Sciences

d〇i：10. 15933/j. cnki. 1004-3268.2017.09.030

BCA-TCA法快速测定烟草蛋白质的研究

翟羽晨王万能，项钢燎张潇骏刘钦

\\14\\\\\\

唐晓莲戴亚

\\2,马扩彦2,谭兰兰3

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆4000; 2.重庆中烟工业有限责任公司，

重庆400060; 3.四川中烟工业有限责任公司，四川成都610000)

摘要：为快速准确地测定烟草中的蛋白质含量，建立并优化了 BCA-TCA法，即提取烟叶蛋白质的 最佳体系条件为pH值7.0的0.05 mol/L PBS缓冲液、液料比40 mL/g，使用TCA沉淀蛋白质，利 用差减法去除烟叶中还原性物质对BCA方法准确性的影响，从而准确测定样品的蛋白质含量。结 果表明：该方法测得的烟叶样品蛋白质含量变异系数小于5%，重复性较好；样品的加标回收率为

96.39%，加标回收变异系数为0.75% <2%，准确度高；BCA -TCA法和克达尔法测定值的t检验

结果为《=1.5 5 <«。.。5,8 =2.306，说明2种方法在95%的置信区间内无显著差异，但建立的8€八-

TCA法将耗时缩短至2.5 ~3.5 h，且操作步骤简捷、所用设备简单。可见，建立的BCA -TCA法能

够快速准确地测定烟草中的蛋白质含量。关键词：烟草；蛋白质；BCA-TCA法；测定

中图分类号：TS41+1 文献标志码：A 文章编号：1004 -3268(2017)09 -0156 -05

Rapid Determination of Tobacco Protein by BCA-TCA Method

ZHAI Yuchen1 ,WANG Wanneng1** , XIANG Gangliao1 , ZHANG Xiaojun1 , LIU Qin1 ,

TANG Xiaolian1, DAI Ya2,MA Kuoyan2, TAN Lanlan3

(1. College of Pharmaceutical and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 4000 , China ；

2. China Tobacco Chongqing Industrial Co. ,Ltd. , Chongqing 400060 , China ；3. China Tobacco Sichuan Industrial Co. , Ltd. , Chengdu 610000, China)

Abstract： For the rapid and accurate determination of the protein content in tobacco,an accurate and ef­

ficient BCA-TCA method was established and optimized. The optimum conditions for extracting tobacco protein were 0.05 mol/L PBS buffer at pH 7.0,and liquid-solid ratio was 40 mL/g. Differential subtrac­tion was used to accurately determine the sample protein content, through removing the impact of interfer­ing substances by using TCA to precipitate proteins. The results showed that the coefficient of variation of protein content was less than 5% and the reproducibility was good. The standard recovery rate of the sam­ples were 96. 39% ,the coefficient of variation was 0. 75% <2% and the accuracy was high. The t test re­sults of the BCA-TCA method and the Kedar method were t

= 1.5 5 < 〇5 8 —

306 , indicating that

there was no significant difference between the two methods in the 95% confidence interval, but the de­tection time of BCA-TCA method would be shortened to 2. 5 —3. 5 h, and the steps were simple, the equipment used was simple. The established BCA-TCA method can quickly and accurately determine the protein content in tobacco.

Key words ： tobacco; protein ； BCA-TCA ； determination

收稿日期=2017 -05 -31

基金项目：川渝中烟工业有限责任公司科技项目（2014Q116)作者简介：翟羽晨（1994 -)，男，山西临汾人，本科，主要从事分析检测方面的研究。E-mail:8411151@qq.C〇m*通讯作者：王万能（1971 -)，男，四川开江人，教授，博士，主要从事生物工程方面的研究。E - mail: wannengw@ cqut. edu. cn

第9期翟羽晨等：

BCA -TCA法快速测定烟草蛋白质的研究

157

烟草是我国重要的经济作物之一，在国民经济 中占有举足轻重的地位。蛋白质是烟叶的重要化合 物，过多的蛋白质会增加烟叶燃烧时的苦味和烧焦 羽毛味[1]，因此，快速准确地测定烟草中的蛋白质 含量对及时评价烟叶品质具有重要意义。蛋白质含 量测定方法有凯氏定氮法、克达尔法、Lowry法、二 喹啉甲酸（BCA)法等[2_4]。国际上常采用克达尔法 或改良的凯氏定氮法测定烟叶蛋白质含量，虽然测 定较准确，但由于操作繁琐、检测周期长，了其 应用和推广[~ ;连续流动分析法已在国内烟草行 业普遍使用[7]，但其耗时达10 h以上[8]，而且这些 方法测得的为总氮量，受样品中非蛋白质氮的影响， 无法真正准确地测得烟叶的蛋白质含量。BCA法 的原理是在碱性环境下蛋白质与Cu2+作用生成的

Cu+，然后与BCA结合形成稳定复合物，该复合物

在562 nm处有最大吸光值，通过测定复合物的浓度 而计算得到蛋白质的含量[9]，该方法具有快速、操 作简便、成本低、灵敏度及准确度高等优点[1 ° _13 ]，但

BCA法测定蛋白质会受到还原性物质的干扰影

响[14]。而三氯乙酸（TCA)可以使蛋白质沉淀，可用 于分离蛋白质[15_16]。鉴于此，根据烟草蛋白质的特 点，使用TCA沉淀蛋白质，利用差减法消除烟叶中 还原性物质对BCA方法测定结果准确性的影响，旨 在为更加精确地测定烟叶中的蛋白质含量提供技术 依据。

1

材料和方法

1.1材料、试剂与仪器

烟叶经过烘干处理后剪碎，粉碎成粉末装于封

口袋中。所用烟叶样品的具体情况见表1。

表1

烟叶样品产地和品名

样品编号

样品产地等级

品名

工艺条件

1#

云南曲靖C3FK32605A02XH 单打2#云南曲靖B2FK32205A03XH3#云南曲靖B2FK32605A03XH 特标4#云南曲靖C3FK3265#云南曲靖C3FK32605A02XH 05A01XHTSSS特标6#云南曲靖C3FK32605A01XHTSSS 单打7#四川凉山云8#C3F85

20B02XH 单打四川凉山C3F红大20B02XH 单打9#四川凉山

C3F

云

85

20B02XH 特标

主要试剂：BCA蛋白质定量试剂盒（SIGMA-

ALDRICH)、磷酸氢二钠（AR)、磷酸二氢钠（AR)、

牛血清蛋白质（AR)、TCA(15%三氯乙酸水溶液）、

PBS(磷酸缓冲液，PH值6~8)。

主要仪器：ELX808酶标仪（美国B1〇 - Tek公

司）、TGL -16M高速台式冷冻离心机（湘仪离心机 仪器有限公司）、ALC -110.4型精密电子天平（德 国赛多利斯集团公司，精度0.000 1 g)、KD -98 -1 型电热恒温水浴锅（南北仪器生产厂）、85 -1数显 恒温磁力搅拌器（金坛市精密仪器制造有限公司）、

SHZ -

D9型循环水式真空泵（上海坦泽仪器设备有

限公司）、DW -86L386超低温保存箱（青岛海尔特 种电器有限公司）、FE20梅特勒-托利多实验室PH 计（梅特勒-托利多上海有限公司）、MP2002型电 子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、QL - 901快速混勻器（其林贝尔仪器制造公司）。1.2方法

1.2.1 试剂的配制 BCA工作液：将BCA试剂盒 中A液（BCA碱性溶液）和B液（硫酸铜溶液）按体 积比50:1混合得BCA工作液，现用现配。蛋白质 标准储备液：BCA试剂盒中提供的2 mg/mL标准蛋 白质母液。

1.2.2

蛋白质标准曲线的制作用PBS将

2 mg/mL

标准蛋白质母液配制成〇、25、50、125、250、500 |xg/mL 系列标准工作溶液。酶标板每孔加人25 |xL标准蛋 白质工作溶液和200 |xL B

CA

工作液，充分混勻，

37 °C水

浴30 m

m,

取出后快速冷却至室温，在波长

为562 nm

处用酶标仪测定标准溶液的吸光度值，制

得标准蛋白质工作曲线。

1.2.3 烟叶蛋白质的提取准确称取0.5 g烟叶 样品粉末于玻璃勻浆器中，加人10 mL PBS研磨。 将勻浆液在4 °C条件下以4 000 r/min离心5 min。 上清液用中速滤纸过滤，离心分离得到的残渣采用

上述方法研磨、离心、过滤，重复上述操作2次。收 集总过滤液用PBS定容至250 mL，得到样品液。

缓冲液浓度、pH值、液料比这3个因素对蛋白 质得率均具有直接影响。分别对PH值、缓冲液浓

度、液料比进行单因素试验优化，确定烟叶中蛋白质 的最佳提取条件，并进行重复性和加标回收试验以 验证其准确性。

1.2.4

提取样品液中蛋白质含量的检测取

1.2.3

所得样品液2 m

L于

10 mL

离心管，加人3倍体积的

PBS，混勻，标

为1

号待测液；另取上述所得的烟叶

样品液2 m

L于

10 mL

离心管，加

3

倍体积的15%

TCA，混勻，于37 °C水浴中孵育10 mm,

再于20 ~

25 °C条件下以10 000 r/min离心10 min[17]，取上清

液标为2号待测液。分别取25 |xL上述2个待测液 于9

6

微孔板中，并在每孔中加人200 |xL B

CA

工作

液，充分混勻，37 °C恒温水浴30 mm,

快速冷却至室

温，用酶标仪测定吸光度值，每个待测液平行测定

158

河南农业科学第46卷

3次，取平均值

根据标准蛋白质的回归曲线方程和待测液样品 的吸光度值计算蛋白质含量，公式如下：

式中J为烟叶样品蛋白质的莨分含量（％ ); F 为样品液定容后的总体积（mL)

为1箸待测液

中与BCA反应的总物质的质曇浓度(>g/ttL) ; C2 为2 #待测液中与BCA反应的非蛋g质的质量浓 度（|Xg/mL.) ;7ra.为所称烟叶样_品质囊| 为水分

校正系数（物质干质量卢总量的育分比为稀释

倍数，

2结果与分析

2.1烟叶样品中蛋白质提取条件的优化

2AA提取液最优pH值的确定分别配制pH •值

为 6.0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0 的 0. 09 mol/L PBS 缓冲液，以液料比.为4〇 mL/g进行棄:白质.提取，按1.2.方 法进行提取和测定，比较蛋白质得率.由图1可见，

当提取液pH值从6. 0上升至8. 0时，烟叶蛋白质 得率呈先升高后下降的趋势，并且在提取液pH值 为7. 〇时，烟叶蛋白质得率最裔，为91.4 mg/心故 选择pH值7. 0为PBS提取液的最优PH值。

〇6.0 '--------6.5

1---------7.0 1--------7.5 1--------8.0

1

提取液pH值

图1提取液

pH值对蛋白质提取的影响

2.1.2 提取液最优浓度的确定_分别配制0. 03 050.01、 、0.、0. 07、0. 09 .md/L 的:pH..值，为 7. 0 的 PBS

缓冲液，以液料比为40 mL/g按1.2方法进行蛋ft 质提取和测定，比较蛋白质提取效率由图2可见， 当缓冲液浓度提高圃〇. 05 m〇l/L后;蛋白质得.率为92.1 mg/g，.之后，继.续增加:缓冲液浓度，.:蛋台,质籍率 棊本保持不变，故选择提取缓冲液浓度为〇. 〇5

mol/L 02.1.3

最优液料比的确定配制0. 05 mol/L pH

值为7. 0的PBS缓冲液，以液料比2:0、30、40、50、 60 mL/g按1. 2方法进行鸾白质提取和测:定比较 蛋白质得率由图3可以看出，提取烟叶蛋旮质的 研磨液料比为40 ml/g时，蛋|由质得率达到最大值，

为93.. 1 mg/g.,随着液料比继续增加，蛋黯质得..率基 本没有太大的变化故选择液料比40 m.L/g为提取 蛋白质的:最优液料比《

f(

)/齋霞5酬

0.01

0.03

0.05 0.07 0.09

提取液浓度/(mol/L)

图2

提取液浓度对蛋白质提取的影响

0

o

♦

f(8 o

)6/ o

齋#4 o

麵惡

2o

0 20 --------30

'--------'--------'--------'

液料比40 50 60

/(mL/g)

图3磨浆液料比对蛋白质提取的影响

2.2方法学考察

2.2.1标准曲线的制作通过试验测定分析，在波 长为562 nm处将测得的吸光度值与对应的蛋白质 质:養浓度进#线性ML. H:归:方程为:y = 〇. 00.1* + 0. 〇〔.j■为吸光度，为蛋白濟质量浓度（|xg/uiL)]， ,=0.997 >0.995,该曲线可作为测定烟叶蛋白质 的标准曲线（图4) 该方程表明，蛋白质质量浓度在 0〜0.5 mg/mL,与吸光度值呈良好的线性关系^

2.2,2重复性验证采用本法测定了 9个烟叶样 品的蛋白质含量，重复3次，结果如表2,所有持测 烟叶样品的蛋白质含量变异系数均小于5%，说明 本法其有较好的重复性

2.2.3 .加标回收试验■取2 niL烟叶样品蛋白提取

第9期翟羽晨等

：BCA -TCA法快速测定烟草蛋白质的研究

可见，样品的加标回收率平均值在

97.25%

，

159

95. 38% ~

液于10 mL离心管中，再加人相当于样品中蛋白质 含量86.96%、108. 70%、130.43%的标准蛋白质溶 液，按1.2中检测方法进行检测，并计算加标回收率 (至少重复试验3次），加标回收数据见表3。由表3

表

变异系数为0. 75% <

2%

，

说明本方法具

有良好的准确度。

2

烟叶样品中蛋白质含量测定结果

样品

1#2#3#4#5#6#7#8#9#

&/( pg/mL)

272.025 5226.208 8284.312 7214.316 4252.765 1234.961 2266.0 6243.093 9258.726 2

C2/(^S/mL)222.816 6202.463 4245.597 9180.153 4208.651 3195.651 5217.331 3205.7 8216.687 5

蛋白质含量/%

平均值

10.475. 178.447.399.538.5110.608. 139.20

最大相对偏差

0.070 70.033 40.032 30.031 30.015 10.042 00.027 40.040 60.033 9

标准偏差

0.423 40.161 50.253 70.224 90.135 70.315 60.298 80.293 30.282 9

变异系数/%

4.043.123.003.051.423.712.823.613.07

表3标准蛋白质加标回收测定结果

样品液中加入蛋白质的比例/%

86.96

样品液蛋白质

含量

184184184

蛋白质加入量

160160160200200200240240240

蛋白质回收量

155.47152.77153.33193.42194.50190.76231.230.09233.18

回收率/%

97.1795.45.8396.7197.2595.36.6295.8797.16

回收率均值/%变异系数/%

108.70184184184

96.390.75

130.43184184184

2.3

BCA-TCA法与克达尔法的比较

为了验证BCA -TCA法测定结果的准确性，参

3

结论与讨论

经优化，烟叶蛋白质提取的最佳体系为pH值

照YC/T 166—2003，按现行的克达尔法同时测定 9个待测烟叶样品中的蛋白质含量，结果见表4。由 表4可以看出，2种方法所测得的蛋白质含量的相 对偏差皆小于6%。对2种方法所测得的结果进行 ^检验，《=1.5 5 <«。。5,8 =2.306，说明2种方法在 95%的置信区间内没有显著差异，目卩BCA -TCA法 可以代替克达尔法测定烟叶的蛋白质含量。

表

7.0 的 0. 05 mol/L PBS 缓冲液、液料比 40 mL/g。

与克达尔法相比，采用B

CA-TCA

法所测得的蛋白

质含量数据相差不大，相对偏差皆小于6%。对 2种方法所测得的结果进行t检验，结果为t =

1. 5 5 <«。_。5>8 =2. 306,说明 2 种方法在 95% 的置

信区间内没有显著差异，即本方法可以代替克达尔 法测定烟叶蛋白质含量。但与克达尔法和连续流动 分析法相比，采用BCA -TCA

4 BCA-TCA法与克达尔法的比较结果 %

蛋白质含量

BCA-TCA法

10.475. 178.447.399.538.5110.608. 139.20

法测定烟叶的蛋白质

烟叶样品

1#2#3#4#5#6#7#8#9#

相对偏差

1.115.141.341.071.871.330.662.581.13

变异系数

1.577.271.901.512.651.0.943.1.60

克达尔法

10.245.738.677.559.188.7410.468.569.41

含量步骤简单、程序不繁，耗时缩短至2.5 ~ 3.5 h; 且该检测方法所用设备简单，离心机、水浴锅和酶标 仪等设备价格便宜，易于移动，方便在烟叶收购站、

烟草储藏库房和卷烟生产线快速检测烟叶中的蛋白 质含量，用于评价烟叶质量，而且利用酶标仪检测具 有快速和通量大的特点，效率较高。

本研究确定的BCA -还原糖和非蛋白质氮对B

TCACA

测定法，因其去除了

法测蛋白质含量的影

响，能更加准确测定烟叶的蛋白质含量，所测数值更

160

河南农业科学

Biochemistry, 1985,150(1) ：76-85.

第46卷

加真实、准确，将本方法进行推广将大大提高实际生 产中烟叶蛋白质含量测定的准确度和效率。

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