云南民族大学学报：自然科学版，２０１５，２４（２）：１２３—１２５ ｄｏｉ：１２．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—８５１３．２０１５．０２．０１０ ＣＮ ５３—１１９２／Ｎ ＩＳＳＮ １６７２—８５ｌ３ ｈｔｔｐ：／／ｘｂ．ｙｎｎｉ．ｅｄｕ．ＣＢ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳法测定蒜头果蛋白的相对分子质量 袁 燕 ，王红斌 ，ＢＡＲＲ０Ｗ Ｃｏｌｉｎ Ｊ ，杨文荣 （１．云南民族大学民族药资源化学国家民委一教育部重点实验室，云南昆明６５０５００； ２．云南民族大学云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南昆明６５０５￣）； ３．澳大利亚迪肯大学生命与环境科学学院化学与生物技术中心，澳大利亚吉朗ＶＩＣ３２１６） 摘要：蒜头果蛋白（ｍａｌａｎｉｎ）是从广西、云南特有植物蒜头果中分离、纯化出的一种新的、具有抗 肿瘤活性的植物蛋白质．采用变性十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）测定 ｍａｌａｎｉｎ的相对分子质量．结果表明，ｍａｌａｎｉｎ是一种双链蛋白质，由Ａ、Ｂ ２条肽链通过二硫键连 接而成，其相对分子质量约为６５．９４×１０’．方法具有简单、快速、直观的特点． 关键词：蒜头果蛋白；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ；相对分子质量 中图分类号：Ｑ５１６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２—８５１３（２０１５）０２—０１２３—０３ 蒜头果（ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ ｃｈｕｎ ｅｔ Ｓ．Ｌｅｅ）属于铁青 １９６７年Ｓｈａｐｉｒｏ等发现，在聚丙烯酰胺凝胶系 树科（Ｏｌａｃａｃｅａｅ）蒜头果属 ，是中国特有单种属稀有 统中加入十二烷基硫酸钠（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ， 植物，国家二级保护树种＿２ Ｊ，广西重点保护野生植物， ＳＤＳ）后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其 仅分布于云南东南部和广西西部的狭窄地带 ｊ． 相对分子质量，而与它的形状及所带电荷无关．因 蒜头果蛋白（ｍａｌａｎｉｎ）是通过粉碎、抽提、硫酸 此，要测定某一蛋白质分子的相对分子质量，只需比 铵沉淀、疏水色谱层析等方法从广西、云南特有植物 较该蛋白质与其他已知相对分＝ 质量的蛋白质在 蒜头果（ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ）中分离纯化出一种新的、 ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳上的迁移率即可 ．本文通 具有抗肿瘤活性的糖蛋白 Ｊ．体外抗肿瘤活性表明 过变性ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳，以相对分子质量的 ｍａｌａｎｉｎ具有明显抑制人宫颈癌（ＨｅＬａ）、人白血病 对数为纵坐标，迁移率为横坐标作回归方程，计算 （Ｋ５６２）、人乳腺癌（ＭＣＦ一７）和神经瘤（ＰＣ一１２） ｍａｌａｎｉｎ的相对分子量，为ｍａｌａｎｉｎ的基本理化性质 等肿瘤细胞体外增殖的能力，其半致死浓度Ｉｃ 。值 提供参考数据． 分别为１．５４×１０ 。、１．５８×１０～、１．１２×１０ 和 １实验材料与方法 ７．７１×１０一ｍｏｌ・Ｌ ，说明ｍａｌａｎｉｎ具有非常强的 １．１实验材料 抗肿瘤活性，可作为抗癌药物的先导分子，具有用于 丙烯酰胺／亚甲基双丙烯酰胺（Ｐｈａｒｍａｃｉａ公 免疫毒素治疗癌症的应用前景． 司）；十二烷基硫基钠（ＳＤＳ）、考马斯亮蓝Ｇ一２５０ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃ． （Ｂｉｏｍ公司）；Ｂ一疏基乙醇、Ｎ，Ｎ，Ｎ ，Ｎ 一四甲基乙 ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＡＧＥ）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介 二胺（ＴＥＭＥＤ）（Ａｍｒｅｓｃｏ公司）；蛋白质分子量标准 质的一种常用电泳技术，由于其机械强度好，透明有 （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒｓ）（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）； 弹性，有较好的化学稳定性和热稳定性，没有吸附作 其余试剂均为国产分析纯． 用和电渗作用，可通过改变丙烯酰胺的浓度和交联 １．２仪器 度而制成不同孔径的凝胶等优点，故被广泛应用于 蛋白质电泳系统（Ｈｏｅｆｅｒ ＳＥ２６０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ公 生物大分子的分离 Ｊ． 司）；Ｍｉｌｌｉ—Ｑ纯水机（ＭＩＬＬＩＲＯＲＥ公司）；万分之一 收稿日期：２０１４—１１—２５． 基金项目：国家自然科学基金（８１２６０５００）；教育国际化平台建设项目（２１８—０２００１００１００２１２９）；云南省“无机化学精品课 程”资助项目（２０１２ＨＸ０８，２０１２ＨＸ１２）． 作者简介：袁燕（１９７５一），女，博士，副教授，硕士生导师．主要研究方向：生物有机化学． １２４ 云南民族大学学报（自然科学版） 第２４卷 天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＢＰ１１０Ｓ）． １．３实验方法 １．３．１ Ｍａｌａｎｉｎ样品的处理 取少量溶液或冻干的样品分别置于１．５ ｍＬ ｅｐ－ ｐｅｎｄｏｆｆ管中，加入等体积比的１×样品缓冲液．震荡 后置于沸水浴中煮沸５ ｍｉｎ．冷却，离心机离心１０ Ｓ， 冷却后备用． １．３．２不连续ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳 按Ｌａｅｍｍｌｉ＿９ 方法进行，分离胶浓度为１２％，浓 缩胶浓度为３％＿】 ． １）铸分离胶．将玻璃板、梳子和隔条用蒸馏水 冲洗净，凉干后，装好模具，用移液器将１２％分离胶 溶液加入模具中，液面距顶端１／３～１／４处，加满去 离子水，自然聚合３Ｏ一６０ ｍｉｎ¨ ． ２）铸压缩胶．待分离胶聚合后，将上层去离子 水倒掉，用滤纸吸干去离子水后注入３％的浓缩胶， 同时插入１Ｏ孔样品梳，待其自然聚合３０ ｍｉｎ 左右 ． ３）上样．将制好的凝胶装进电泳槽，加入电泳 缓冲液（１×），取出梳子，每孔加１５ Ｌ样品． ４）电泳测定．接通电泳仪电源进行电泳分析， 待溴酚蓝到达凝胶的底部时，关闭电源，停止电泳． ５）染色与固定．电泳完毕后，将分离胶小心地 从玻璃板上取下，放入装有考马斯亮蓝Ｇ一２５０染 色液的表面皿中，用摇床染色３０ ｍｉｎ左右 ． ６）脱色．染色与固定后的凝胶浸于脱色液中脱色， ３０ ｍｉｎ左右换一次脱色液，直至无蛋白质处无色透明 为止． ７）保存．脱色后凝胶用数码相机照相保存． １．３．３ Ｍａｌａｎｉｎ相对分子质量的测定 分子量测定按Ｆａｉｒｂａｎｋｓｌｔ４３方法，以相对分子质 量的对数为纵坐标，迁移率为横坐标作直线回归图， 以回归方程计算出相对分子质量． ２结果与分析 ２．１不连续ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳 图１中第３孔可以看到只有一条带，说明ｍａｌａ— ｎｉｎ纯度比较高，用Ｂ一巯基乙醇处理后的ｍａｌａｎｉｎ 被裂解成２个条带，分子量小的下面那条带命名为 Ａ链，分子量大的上面那条带命名为Ｂ链（图１的 第４个孔道）．此结果说明ｍａｌａｎｉｎ是一种双链蛋白 质，由Ａ、Ｂ ２条肽链通过二硫键连接而成的． ２．２ Ｍａｌａｎｉｎ相对分子质量的测定 由于蛋白质的迁移率与分子质量成正比，因而可 以用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳来测定蛋白质的分子质量．通过 已知蛋白质的分子质量常用对数与相对迁移率（ ）绘 制出标准曲线，未知蛋白质的分子则可由标准曲线上 查出．Ｒ ＝蛋白质的迁移距离／示踪染料距离．蛋白质 的迁移距离是指从分离胶的起始位到蛋白质条带的 前沿 ． ｋｕ ２２５ １５Ｏ １００ ７５ ５０ ■ 一 Ｂ 簟 一Ａ １．蛋白质标准品；２．粗蛋白；３．蒜头果蛋白 ４．加入Ｂ一巯基乙醇处理的蒜头果蛋白（Ａ、Ｂ链） 图１ ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图 ｆ 图２ Ｍａｌａｎｉｎ相对分子量的测定 按Ｆａｉｒｂａｎｋｓ方法，以标准蛋白质分子质量的对 数与相对迁移率（兄）作直线回归图，由回归方程即 可算出ｍａｌａｎｉｎ及其Ａ、Ｂ链的相对分子质量．图２ 得出的直线方程为：Ｙ＝一１．５３０４ ＋２．２８２ ３，根屠 ｍａｌａｎｉｎ及Ａ、Ｂ链的ＪＲｆ值可以算出ｍａｌａｎｉｎ及Ａ、Ｂ 链的相对分子质量分别为６５．９４ Ｘ １０ 、３０．０５ Ｘ １０ 和２０．９４ Ｘ １０ ． ３结果与讨论 采用不连续变性ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳法，以 相对分子质量的对数为纵坐标，迁移率为横坐标作 回归方程，得到ｍａｌａｎｉｎ的相对分子量６５．９４×１０ ， 由于加入Ｂ一巯基乙醇处理后，蒜头果蛋白被裂解 成二条链，其相对分子质量分别为３Ｏ．０５×１０。和 ２０．９４×１０ ，说明ｍａｌａｎｉｎ是由Ａ、Ｂ ２条肽链通过二 硫键连接而成，此结果为ｍａｌａｎｉｎ的基本理化性质 第２期 袁燕，王红斌，ＢＡＲＲＯＷ Ｃｏｌｉｎ Ｊ，等：ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳法测定蒜头果蛋白的相对分子质量 １２５ 提供较好的参考数据．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳法测定蛋白 ［６］李慧，吴恩应，张运佳．低毒高效的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ考马斯 质的分子质量具有简便、快速、重复性好的优点，是 亮蓝染色方法比较［Ｊ］．生物技术通讯，２０１１（２）：２６１ 目前鉴定蛋白质纯度及测定分子质量比较好的方 —２６３． 法．但由于电泳方法测定的蛋白质分子质量误差较 ［７］马歇克Ｄ Ｒ，门永Ｊ Ｔ．蛋白质纯化与鉴定实验指南 大，一般在５％一１０％之间．近几年出现的基质辅助 ［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９９． 激光解吸电离质谱和电喷雾电离质谱能实现相对分 ［８］郭勇．现代生化技术［Ｍ］．２版．北京：科学出版 社，２００８． 子质量在几万以上大分子蛋白质的精确测定，成为 ［９］ＬＡＥＭＭＬＩ Ｕ Ｋ．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ 质谱学家和生化学家的一个研究热点．本文采用基 ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ＂１４［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ， 质辅助激光解吸飞行时间质谱（ｍａｔｉｒｘ—ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａ— １９７０，２２７：６８０—６８５． ｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ—ｏｆ—ｆｌｉ ｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃ— ［１０］孙波，迟玉杰，徐宁，等．Ｔｒｉｃｉｎｅ—ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳检 ｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ）测定ｍａｌａｎｉｎ相对分子 测蛋清肽分子量的研究［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（５）： 质量为６１．８７５ Ｘ １０ ，其误差为６．６３％，结果令人 ３８５—３８８． 满意． ［１１］邸瑶，张丽萍，夏红梅．十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺 凝胶电泳的实验教学改进［Ｊ］．实验室科学，２０１１（１）： 参考文献： ５８—５９． ［１］丘华兴，林有润．中国植物志（２４卷）［Ｍ］．北京：科学出 ［１２］林方养，杨耀东，万婕，等．不同染色剂对ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 版社，１９８８． 染色体系的影响［Ｊ］．安徽农业科学，２０１４（９）：２５６２ ［２］傅立国．中国植物红皮书一稀有濒危植物（第一册） —２５６３． ［Ｍ］．北京：科学出版社，１９９２． ［１３］吴远双，宋玉竹．一种考马斯亮蓝Ｇ一２５０快速染色法 ［３］广西林业局保护站．广西壮族自治区重点保护野生植 在ＳＤＳ—ＰＡＧＥ中的应用［Ｊ］．： 谱实验室，２０１３，３０ 物资源调查报告［Ｒ］．南宁，２００１． （６）：３１０９—３１１３． ［４］ＹＵＡＮ Ｙ，ＤＡＩ Ｘ Ｃ，ＷＡＮＧ Ｄ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃ． ［１４］ＦＡＩＲＢＡＢＮＫＳ Ｇ，ＴＨＥＯＤＯＲＥ Ｌ Ｓ，ＷＡＬＬＡＣＨ Ｄ Ｆ Ｈ． ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍａｌａｎｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｎｔ ｔｏｘｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｎａａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｎ，２００９，５４： ｈｕｍａｎ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９７１，１０ １２１—１２７． （１３）：２６０６—２６１７． ［５］张瑶，刘芳，张页．一种改良的蛋白质电泳考马斯亮蓝Ｇ ［１５］汪家政，范明．蛋白质技术手册［Ｍ］．北京：科学出版 一２５０染色方法［Ｊ］．基础医学与临床，２０１２（８）：９５３ 社，２００４． ．．９５５ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎａｓｓ ｏｆ ｍａｌａｎｉｎ ｗｉｔｈ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ＹＵＡＮ Ｙａｎ ，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ—ｂｉｎ ，ＢＡＲＲＯＷ Ｃｏｌｉｎ Ｊ ，ＹＡＮＧ Ｗｅｎ—ｒｏｎｇ。 （１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｙｒ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｙｒ ｉｎ Ｅｔｈｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｓｔａｔｅ Ｅｔｈｎｉｃ Ａｆｆａｉｒｓ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｎｉｓｔｙｒ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｙｕｎｎａｎ Ｍｉｎｚｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００３１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉｌａｓ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ， Ｙｕｎｎａｎ Ｍｉｎｚｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５Ｏ５０ｏ，Ｃｈｉｎａ；３．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｌａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅａｋｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｅｅｌｏｎｇ，ＶＩＣ ３２１６，Ａｕｓｔｒａｌｉａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｌａｎｉｎ，ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｎｄｅｍｉｃ ｐｌａｎｔ ｏｆ ｍａｌａｎｉａ ｏｌｅｉｆｅｒａ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ａｎｄ Ｙｕｎｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ｍａｌａｎｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｈａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍａｌａｎｉｎ ｉｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｔｗｏ ｃｈａｉｎｓ，ｃｈａｉｎ—Ａ ａｎｄ ｃｈａｉｎ—Ｂ，ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｃｒｏｓｓ—ｌｉｎｋｅｄ ｂｙ ｏｎｅ ｏｒ ｔｗｏ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄｓ，ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｉｓ ａｂｏｕｔ ６５ ９４ Ｘ １０ ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｓ ａ ｓｉｍｐｌｅ， ｆａｓｔ，ｄｉｒｅｃｔ—ｖｉｅｗｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ ｍａｌａｎｉｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍａｌａｎｉｎ；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ；ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｗｅｉｇｈｔ （责任编辑王琳）
