２０１ １年３９卷第ｌ４期 广州化工 ・９９・ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ测定大蒜功能性蛋白的相对分子质量木 彭继千，徐宽 ４１００８３） （中南大学化学化工学院，湖南 长沙摘 要：建立用ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）测定大蒜功能性蛋白的组成及相对分子质量（Ｍｒ）。通过电泳考 察大蒜冻干粉中的蛋白组分，对标准蛋白进行直线回归分析，确定大蒜冻干粉中功能性蛋白的相对分子质量。此法供试品的处理方 便、用量少，分离胶（交联度为１０．Ｏ％，丙烯酰胺总浓度为３．０％）中能较清晰显示相对分子质量低的蛋白条带，是一种测定相对分子 质量低蛋白较好的方法。 关键词：大蒜功能性蛋白；ＳＤＳ—ＰＡＧＥ；相对分子质量；膜分离；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｇａｒｌｉｃ ｂｙ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ＰＥＮＧ ｊｉ—ｑｉａｎ，ＸＵ Ｋｕａｎ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｎａｎ Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｇａｒ－ ｌｉｃ ｗａｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅ— ｓｕｉｔｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｗｄｅｒ ｗｉｔｈ ＳＤＳ——ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌ ａｔ ｈｉｇｈｅｒ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（１０．０％Ｔ，３．Ｏ％Ｃ）ｗａｓ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｇａｒｌｉｃ；ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ；ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ 大蒜为百合科葱属多年生草本植物蒜（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ）的 鳞茎。大蒜作为日常生活中不可缺少的调料之外，还具有非常 冷冻干燥后所得）３批（独头大蒜、紫皮大蒜、白皮大蒜）；实验室 提取白皮大蒜功能性蛋白溶液３批（超滤残留液、纳滤残留液、 纳滤滤过液）。 多功能膜分离设备（配有超滤膜、纳滤膜、反渗透膜）芜湖 重要的营养价值。以往研究中对大蒜脂溶性成分大蒜素的研究 较多，而极有研究价值且副作用很小的大蒜功能性蛋白却少见 报道…。大蒜功能性蛋白主要为多种抗氧活性很高的酶类，其 中超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）在大蒜中含量丰富，１００ ｇ大蒜中含量 普朗膜技术有限公司；ＤＹＣＺ一２４ＥＮ型垂直板电泳槽、ＤＹＹ— ＩＯＣ型电泳仪（电脑三恒多用电泳仪），北京市六一仪器厂；ＧＤＳ 一高达１７．６ ｍｇ Ｊ。ＳＯＤ是目前为止所发现的唯一以超氧阴离子 自由基Ｏ 为底物的酶，它在维持生物机体内Ｏ 产生与消除的 ８０００凝胶图像分析仪（ＬａｂＷｏｒｋｓ图像获取与分析软件），Ｕｈｒａ Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｅｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ。 —动态平衡中起重要作用。国外已有多种药用ＳＯＤ应用于临床， 主要集中于抗炎、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老及自身免疫性疾病等 由超氧阴离子自由基引发的疾病 。实验样品大蒜功能性蛋 １．２实验方法 １．２．１电泳液的配制 丙烯酰胺单体贮液：１４．５５ ｇ丙烯酰胺＋０．４５ ｇ Ｎ，Ｎ’一甲叉 双丙烯酰胺溶解在５０ ｍＬ双蒸水中过滤；浓缩胶缓冲液贮液 （１ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ６．８）：６．０６ ｇ Ｔｒｉｓ＋４０ ｍＬ双蒸水＋ ４ ｍｏｌ／Ｌ盐酸，调节ｐＨ至６．８，再用双蒸水加至５０ ｍＬ；分离胶缓 冲液贮液（１．５ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｆｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ８．８）：９．０８ ｇ Ｔｒｉｓ＋４０ ｍＬ双 蒸水＋４ ｍｏｌ／Ｌ盐酸，调节ｐＨ至８．８，再用双蒸水加至５０ ｍＬ；电 极缓冲液：６．０ ｇ Ｔｒｉｓ＋２８．８ ｇ甘氨酸＋１．０ ｇ ＳＤＳ，加双蒸水至 １ ０００ ｍＬ；样品缓冲液（０．０８ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，ｐＨ ６．８）：１．６ ｍＬ 白在大蒜经粉碎萃取、膜分离及冷冻干燥后所得的冻干粉中含 量丰富”Ｊ，通过ＳＤＳ—ＰＡＧＥ考察冻干粉中蛋白的组成及相对分 子质量。国内外未见关于ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分离大蒜功能性蛋白的 报道。 １材料与方法 １．１材料与仪器 标准蛋白试剂盒（Ｍｒ：１４ ４００～９７ ４００），中国科学院上海生 化化学研究院；实验室提取大蒜功能性蛋白冻干粉（纳滤浓缩液 浓缩胶缓冲贮液＋４ ｍＬ １０％ＳＤＳ＋１ ｍＬ Ｂ一巯基乙醇＋２．５ ｍＬ ８７％甘油＋．０１ ｍｇ溴酚蓝，加双蒸水稀释到２０ ｍＬ【８ 。 基金项目：国家外国专家局引进国外技术、管理人才项目（Ｎｏ：Ｇ２００５４３００００１）。 作者简介：彭继千（１９８３一），男，湖南，硕士研究生，研究方向为天然产物的提取、分离与纯化。Ｅ—ｍａｉｌ：ｐｅｎｇｊｉｑｉａｎ１９８３＠１６３．ｔｏｍ ・ｌ０ｏ・ 广州化工 ２０１１年３９卷第ｌ４期 １．２．２凝胶的制备 按表１方法分别配制分离胶和浓缩胶，依次灌胶。 表１ 分离胶和浓缩胶的组成 １．２．３供试品的处理 取标准蛋白与供试品大蒜冻干粉用双蒸水配成５ ｍｇ／ｍＬ的 溶液，再加入等体积的样品缓冲液，１００℃加热５ ｍｉｎ。 １．２．４电泳条件 内外槽均用电极缓冲液，控制电压８０ Ｖ、电流３０ ｍＡ约ｌ０ ｍｉｎ，当指示剂进入分离胶时，控制电压升至１５０ Ｖ、电流升至５０ ｍＡ约１．２ ｈ。 １．２．５固定、染色、脱色和胶的保存 固定液：三氯醋酸４０ ｇ加双蒸水２００ ｍＬ，电泳完毕时将凝胶 置于固定液中固定１ ｈ；然后将凝胶置于加热至６０℃的染色液 （Ｏ．２９ ｇ考马斯亮蓝Ｒ一２５０＋６０ ｍＬ乙醇＋２０ ｍＬ冰醋酸＋１７０ ｍＬ双蒸水）中３０ ｍｉｎ；转至脱色液（２５０ ｍＬ ９５％乙醇＋８０ ｍＬ冰 醋酸，加水至１ ０００ ｍＬ）中扩散脱色，多次更换并加热脱色液直 至背景清晰。凝胶保存在保存液中（保存液：冰醋酸７５ ｍＬ加水 至ｌ ０００ ｍＬ）。用凝胶图像处理系统记录结果并计算。 ２结果与讨论 ２．１ 白皮大蒜萃取液过膜分离《超滤和纳滤Ｊ后的电 泳 本实验将白皮大蒜萃取液过膜分离，将超滤残留液、纳滤残 留液、纳滤滤过液及纳滤残留液的冻干粉作为供试品，电泳后得 电泳如图１，标准蛋白的标准曲线如图２。 图１ 白皮大蒜功能性蛋白过膜分离后一ＳＤＳ—ＰＡＧＥ １、６：标准蛋白；２：超滤残留液；３：纳滤残留液； ４：纳滤滤过液；５：纳滤残留液的冻干粉 ５．０ ４．８ ４．６ 蓦 一４ ４ ４ ２ ４．Ｏ ０．０ ０．２ ０．４ ０．６ ０．８ １．０ 相对迁移率Ｒｆ 图２标准蛋自的标准曲线 如图１所示，通道２中蛋白条带的分离表明进入膜分离机 前的大蒜萃取液中含有大量的相对分子质量在６６ ２００以上的蛋 白，通道３表明超滤膜截留了大部分相对分子质量在６６ ２００以 上的蛋白，通道４表明纳滤膜对超滤滤过液起到了浓缩的作用。 通道１、６显示６条标准蛋白能很好的分离，对其相对分子质量的 对数（１ｇＭｒ）和在分离胶中相对迁移率进行直线回归分析（图 ２），回归方程为 Ｙ：一０．９８４５Ｘ＋５．０５０２１，相关系数Ｒ＝一０．９８９９９ 处理得出通道３、５中不同条带蛋白的相对迁移率，从曲线 图中查得其相对分子质量从大到小依次为：７１ １００、６２ ８００、 ５３ ２００ ４７ ６０Ｏ ４１ ４０Ｏ ３６ １００ ３４ ２００ ２９ ８００，２６ ７００ ２．２ 三种不同品种大蒜萃取液过膜分离后冻干粉的 Ｏ９ Ｏ６ ０ ４一 Ｏ ３ Ｏ 一伽２ ０ 电泳 将不同品种的大蒜（独头大蒜、紫皮大蒜、白皮大蒜）萃取液 分别过膜分离机，将纳滤浓缩液冷冻干燥得三种干燥粉，电泳后 电泳如图３，标准蛋白的标准曲线如图４。 ４ 图３ ｉ种不同品种大蒜冻干粉一ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｌ、５：标准蛋白；２：独头大蒜冻干粉；３：紫皮大蒜冻干粉； ４：白皮大蒜冻干粉 ５．０ ４ ８ －４ ６ 譬 一４．４ 制剂 ４ ２ 清溶苗酶 ４ ０ ０ ０ ０．２ ０ ４ ０．６ ０．８ １．０ 相对迁移率Ｒｆ 图４标准蛋白的标准曲线 ２０１ １年３９卷第１４期 广州化工 参考文献 ・ｌ０１・ 如图３所示，通道１、５显示６条标准蛋向能很好的分离，对 其相对分子质量的对数（１ｇＭｒ）和在分离胶中相对迁移率进行直 线回归分析（图４），回归方程为 ［１］ Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｖｉｅｊｏ．Ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅａｌ Ｂｉｏａｅｔｉｖｅ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｏｆ Ｇａｒｌｉｃ［Ｊ］． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２ｏｏ７，９：７１６—７２５． Ｙ＝一０．９６０４７Ｘ＋５．０５０２２，相关系数Ｒ＝一０．９８９９８ ［２］陈能煌，伍睿．大蒜研究进展［Ｊ１．天然产物研究与开发。２０００， １２（２）：６７—７４． 经处理得知通道２、３、４中相应位置的条带蛋白具有相同的 相对迁移率，即相应位置的条带蛋白具有相同的相对分子质量， 从曲线中查得通道２、３、４中蛋白的相对分子质量从大￣ｌｌｄ，依次 【３］ Ｚａｋａｒｉａ Ｅ１ Ａｓｔａ１．Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｇａｒｌｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ ＲｅｓＴｅｃｈｎｏｌ，２００４， ２１８：４６Ｏ一４６４． 为：７１ １００、６２ ８００、５３ ２００、４７ ６ＯＯ、４１ ４００、３６ １００、３４ ２００、２９ ８００、 ２６ ７００。图３说明不同品种大蒜在一定范围内功能性蛋白的种 类相似，但从条带的宽度不一可知每种蛋白的含量不同，即不同 品种大蒜均具有一定的抗氧化性能，但是大蒜抗氧化性能因品 种不同而不同 Ｊ。 ３ 结论 凝胶电泳以其操作简单、分辨率高等优点在蛋白质相对分 子质量的测定中得到广泛应用。由于ＳＤＳ电泳分离并不取决于 蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后ＳＤＳ一蛋白质胶束的大 小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。在常规Ｔｒｉｓ一甘氨酸一 盐酸系统中，对于相对分子质量低于１５ ０００的多肽，电泳的分辨 率难以满足要求。Ｓｃｈａｇｇｅｒｌ １等使用浓缩胶，增加缓冲液的摩尔 浓度，并且用ｊ羟甲基氨基甘氨酸（ｔｒｉｅｉｎｅ）代替甘氨酸作为终止 离子（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｏｎ），这样便可在１ ０００～１００ ０００得到线性关 系；Ｋｙｔｅ… 等发现由２５～２５０个残基组成的多肽可用含有 ８ ｍｏｌ／Ｌ尿素和０．１％ＳＤＳ的２０％ＰＡＧＥ来分离；张晓楠等 采 用尿素ＳＤＳ—ＰＡＧＥ法快速测定了相对分子质量为２ ５００— １７ ０００的多肽。Ａｎｄｅｒｓｏｎ等＿ 】还发展了一种分别利用两种电泳 迁移率高的强电解质离子为前导离子及拖尾离子的不连续系 统，合并使用８ ｍｏｌ／Ｌ尿素和ＳＤＳ，和含有高百分浓度的交联剂， 在供试品相对分子质量为２ ５００～９０ ０００范围内获得了较满意 的分离效果。用不连续电泳的浓缩胶和分离胶的分子筛效应能 提高分辨率，但对相对分子质量小于１５ ０００的供试品不但应该 使用ＳＤＳ一尿素系统，最好还用高交联度凝胶” 。 不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 对于具有不同迁移率的多组分供试品，很难选择一种浓度的凝 胶来分离。因本品为天然提取产物，成分较为复杂，相对分子质 量范围较宽，而根据相关资料【ｌ ｊ，确定大蒜功能性蛋白中相 对分子质量在２２ ０００以上组分为有效成分，故采用相对分子质 量低蛋白标准进行相对分子质量测定。 ［４］ Ｍｏｕｓｕｍｉ Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｐｒａｂｉｒ Ｋ．Ｓ￣ｋａｒ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｒｌｉｃ ｏｎ ｂａｃ・ ｔｅｒｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｆｒｏｍ ｓｐｉｃｅｓ［Ｊ］．Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏ－ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００３，ｌ９：５６５—５６９ ［５］Ｊ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｓ．Ｌ．Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｓ．Ｐｌｕｍｍｅｒ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＡＩ・ ｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ｇａｒｌｉｃ）［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌ，２００１，５７：２８２ —２８６． ［６］ 吴雅红，吕钱江，方岩雄，等．膜分离技术及其在医药行业中的应用 ［Ｊ］．广州化学，２００２，１２（４）：６１—６４． ［７］甚威，杨栋梁，刘佳佳，等．膜分离提取大蒜ＳＯＤ及其水溶性多肽研 究［Ｊ］．化学工程与装备，２００８（】０）：１４一】８． ［８］郭尧君．蛋白质电泳试验技术［Ｍ］．北京：科学出版社，２００５：９２一 ｌｌ８． ［９］ 回瑞华，侯冬岩，刘晓嫒，等．不同产地大蒜抗氧化性能的研究［Ｊ］． 鞍山师范学院学报，２００８，１０（２）：１５—１８． ［１Ｏ］Ｓｃｈａｇｇｅｒ Ｈ，Ｊａｇｏｗ Ｇ．Ｔｒｉｅｉｎｅ—ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍ－ ｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｆｒｏｍ １ ｔｏ １００ ｋＤａ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏｅｈｅｍ，１９８７，１６６（２）：３６８—３７９． ［１ １］Ｋｙｔｅ Ｊ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＨ．Ａ ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｅｌｅｅｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａ－ ｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｃｅｈｅｍ，１９８３，１３３ （２）：５１５—５２２． ［１２］张晓楠，张延凤，曹云新，等．尿素一ＳＤＳ—ＰＡＧＥ快速测定多肽的相 对分子质量［Ｊ］．细胞与分子免疫学杂志，２００１，１７（１）：８７—９７． ［１３］Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ Ｌ，Ｂｅｒｒｙ Ｒ Ｗ，ＴｅｌｓｅｒＡ．Ａ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｅｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ—ｐｏｌｙ— ａｅｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｃｅｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｓｅｐａｒａｔｅｓ ｐａｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏ－ ｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ２５００ ｔｏ ９０，０００［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏ－ ｃｈｅｍ，１９８３，１３２（２）：３６５—３７５． ［１４］陈亚飞，孙字，高丰衣，等．ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛇毒 抗瘤蛋白的相对分子质量［Ｊ］．中国生化药物杂志，２００４，２５（５）： ３００—３０３． ［１５］李益新．超氧化物歧化酶的结构和功能［Ｊ］．生物化学与生物物理 学进展，１９８５（３）：１５—２１． ［１６］迟乃玉，张庆芳，刘长江．ＳＯＤ的化学特性及其应用［Ｊ］．沈阳农业 大学学报，１９９９，３０（２）：１７１—１７５．
