香菇菌株ITS序列分子检测

ＥＤＩＢＬＥＦＵＮＧＩＯＦＣＨＩＮＡ

ＣＮ５３－１０５４／ＱＩＳＳＮ１００３－８３１０

香菇菌株ＩＴＳ序列分子检测＊

杨永彬，林远崇，兰家细，杨淑云，羿红＊＊

（福建省蚕桑研究所，福建福州３５０００３）

摘要：根据真菌核糖体通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４扩增出１３个福建袋栽香菇主要菌株的ＩＴＳ、５．８ｓｒＤＮＡ序列，将该序列提交ＮＣＢＩ中Ｇｅｎｂａｎｋ数据库，并根据该序列特征及ＩＴＳ区的差异性，分别设计出针对菌株Ｌ９０１５和菌株Ｃｒ０２进行ＰＣＲ检测的特异引物探针，结果显示特异引物具有良好的特异性。关键词：香菇；菌株；ＩＴＳ５．８ｓｒＤＮＡ；特异引物中图分类号：Ｓ６４６．１＋２

文献标识码：Ａ

文章编号：１００３－８３１０（２００８）０２－００３７－０２

香菇Ｌｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ（Ｂｅｒｋ）Ｓｉｎｇ菌种的质量直接影响着香菇的产量和品质。由于我国尚未建立食用菌品种登记制度，在菌种方面缺乏统一管理，因此常导致劣质菌种流入生产领域，不仅造成重大经济损失，也制约了我国香菇产业持续、健康、快速发展。

近年来，利用扩增ＩＴＳ、ｒＤＮＡ基因区段来对食用菌菌株进行遗传分析和分子鉴定的技术得到了发展

［１～４］

１．４供试菌株的ＩＴＳ、ｒＤＮＡ序列扩增及测序１．４．１引物及ＰＣＲ反应体系

采用通用引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４，由上海申能生物科技有限公司合成。５０μＬＰＣＲ反应体系为：１０×ｂｕｆｆｅｒ

Ｌ，ｄＮＴＰ４μＬ，引物各４μＬ（５μＭ），ＴａｋａｒａＥｘＴａｑ５μ

０．２５μＬ，ＤＮＡ模板２μＬ，无菌去离子水补足至５０μＬ，Ｍｉｎｅｒａｌｏｉｌ覆盖。扩增程序：９４℃３ｍｉｎ；９４℃１ｍｉｎ、５１℃１ｍｉｎ、７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物

用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测，ＥＢ染色观察。

。我

们拟对福建省袋栽香菇主要菌株的５．８ｓｒＤＮＡ、ＩＴＳ序列用真菌核糖体通用引物ＩＴＳ１（５’－端５’－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴ－）和ＩＴＳ４（３’－端５’－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴ－ＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’

）进行ＰＣＲ扩增ＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３’

［５］

１．４．２供试菌株ＩＴＳ、ｒＤＮＡ序列克隆、测序

将目标ＤＮＡ谱带从琼脂糖凝胶中切下，将纯化产物连接到Ｔａｋａｒａ公司的ＰＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ上，转化大肠杆菌

，通过对其５．８ＳｒＤ－

ＮＡ、ＩＴＳ序列的测序，并根据ＩＴＳ区的差异性，分别设计

出针对Ｌ９０１５和Ｃｒ０２菌株进行ＰＣＲ检测的特异引物探针。

ＤＨ５α感受态细胞，用含Ｘ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的氨苄抗性平板筛

选，挑白色菌落培养，提取质粒后做ＰＣＲ检测。由上海鼎安生物科技有限公司对成功克隆的菌株提取质粒测序，所得序列经比对分析后在Ｇｅｎｂａｎｋ中注册登录。

１材料与方法

供试菌株为Ｌ９０１５、Ｃｒ０２、Ｌ２４１－４、Ｌ９３９、Ｃｒ３３、

１．１供试菌株

Ｌ１３５、Ｃｒ６２、Ｌ２６、Ｌ４２、Ｌ６６、Ｌ０８７、闽丰１号、Ｃｒ０４，

试验编号依次为１～１３。１３个菌株均为福建省食用菌菌种站保藏菌种。

１．２供试培养基

马铃薯２００ｇ、葡萄糖２０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・

结果与分析

２．１１３个菌株的ＩＴＳ、５．８ｓｒＤＮＡ序列ＰＣＲ扩增结果

扩增结果如图１所示，从图１可看出，引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４能成功扩增出１３个菌株的ＩＴＳ、５．８ｓｒＤＮＡ区段，且该片断大小为７２０ｂｐ左右，这与已报道过的香菇菌株该片

断大小完全相符。

２

７Ｈ２Ｏ１．０ｇ、水１０００ｍＬ。１．３基因组总ＤＮＡ的提取１．３．１菌丝体培养

将香菇菌种接种在液体培养基中，于２５℃静置培养

２．２１３个菌株的ＩＴＳ、５．８ｓｒＤＮＡ序列克隆、测序

将ＰＣＲ产物克隆、测序后，所得序列结果经碱基比对和分析后提交ＮＣＢＩ中的Ｇｅｎｂａｎｋ数据库，并获得Ｇｅｎ－

ｂａｎｋ中的登录号，结果如表１所示。

２．３基于ＩＴＳ、５．８ＳｒＤＮＡ序列设计的特异检测引物设计

利用Ｐｒｉｍｅｒｐｒｅｍｉｅｒ中的ｐｒｉｍｅｒ程序（软件版本５．０），针对ＩＴＳ区突变较大的Ｌ９０１５菌株和Ｃｒ０２菌株进行特异引物设计，软件分析结果表明，引物对１：Ｆｏｒｗａｒｄ１ＴＧＧＴＧ－

７ｄ，用４００目铜网过滤，收集菌丝，置－２０℃贮存备用。１．３．２ＤＮＡ提取

收集培养液中的香菇菌丝，采用李刚等的方法提取香菇基因组总ＤＮＡ。

［６］

（２０００年）

＊基金项目：福建省自然科学基金（Ｂ０５１００３６）作者简介：杨永彬，

（１９７７－），男，硕士，农艺师，主要从事食用菌生理生化及分子生物学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｂｙａｎｇｂｉｏ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ

＊＊通讯作者：ｈｏｎ．ｙ＠２６３．ｎｅｔ收稿日期：２００８－０１－０６

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中国食用菌ＥＤＩＢＬＥＦＵＮＧＩＯＦＣＨＩＮＡＶｏｌ．２７Ｎｏ．２

和Ｒｅｖｅｒｓｅ２ＧＣＡＴＴＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴ则可用来标记菌株Ｃｒ０２的特异引物探针。

２．４引物特异性的验证

用上述针对特定菌株设计的引物分别ＰＣＲ扩增菌株

Ｌ９０１５和菌株Ｃｒ０２，结果如图２和图３所示

图１引物ＩＴＳ１和ＩＴＳ４对１３个菌株的ＰＣＲ扩增

从图２和图３可知，引物对１菌株Ｌ９０１５可特异扩增出片断大小约为５４０ｂｐ的序列；引物对２可特异性的扩增出菌株Ｃｒ０２片断约为１８０ｂｐ左右的序列，显示出作为标记菌株Ｌ９０１５和Ｃｒ０２的特异性。

Ｆｉｇ．１ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｂｙｐｒｉｍｅｒＩＴＳ１＆ＩＴＳ４ｏｎｔｈｉｒｔｅｅｎｓｔｒａｉｎｓ

表１１３个菌株在Ｇｅｎｂａｎｋ中的登录

Ｔａｂ．１ＳｔｒａｉｎａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒｓｉｎｔｈｅＧｅｎｂａｎｋｄａｔａｂａｓ

总结与讨论

３．１从对１３个菌株的ＩＴＳ、５．８ｓｒＤＮＡ序列分析来看，除了菌株Ｌ９０１５和菌株Ｃｒ０２在ＩＴＳ区突变较大外，其余菌

株差异较小，这可能与有些菌株在进化过程中此区段变异较小有关。

３

３．２从本实验结果来看，由于ＩＴＳ、５．８ｓｒＤＮＡ片断较小

和短，因此对于菌株之间的区分有一定的局限性，笔者认为，可能对一些大的区段如１８ｓｒＤＮＡ可能效果更好。

３．３分子生物学技术是区分鉴定菌株的有效手段之一，

但要在菌株层面进行区分鉴定，除了分子水平进行差异分析外，如果能结合传统的分类鉴定方法，如生理生化、出菇品比试验等可能更为准确些。

参考文献

鉴定方法［Ｊ］．［１］杨永彬，等．基于分子生物学技术的食用菌菌株标记、

福建农业科技，２００６（增刊）：１０８～１１１．

［２］王立安，等．大豆疫霉的ＩＴＳ分子检测［Ｊ］．南京农业大学学报，

２００４，２７（３）：３８～４１．

［３］沈洪，等．云南羊肚菌ｒＤＮＡ的ＩＴＳ序列与亲缘关系分析［Ｊ］．食用

图２

引物对１对菌株

图３

引物对２对菌株

菌学报，２００７，１４（２）：１５～１８．

Ｌ９０１５的ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．２

ＰＣＲｒｅｓｕｌｔ

ｂｙｐａｉｒ

Ｐｒｉｍｅｒ１ａｍｐｌｉｆｉｃ

Ｃｒ０２的ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．３

ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｂｙｐａｉｒ

Ｐｒｉｍｅｒ２ａｍｐｌｉｆｉｃ

［４］付立忠，等．四个红菇科菌株的ｒＤＮＡＩＴＳ序列分析和系统发育研究

［Ｊ］．食用菌学报，２００７，１４（２）：２３～２８．

［５］ＨＳＫｗａｎ，ＫＭＰａｎｇ，ＳＷＣｈｉｕｅｔｃ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅ５．８Ｓ

ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｏｆＬｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，１９９２，２０（３）：６１０．

［６］李刚，李宝健．一种简单高效提取食用菌总ＤＮＡ的方法［Ｊ］．中山

大学学报（自然科学版）２０００，３９（２），５６～５８．

ＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧ和Ｒｅｖｅｒｓ１ＴＴＣＧＴＡＴＴＧＴＡＴＴＣＣ－ＴＡＣＣＴＧＡＴＴＴ可以作为标记菌株Ｌ９０１５的特异引物探针；

而引物对２：Ｆｏｒｗａｒｄ２ＴＴＧＴＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＴＣＧＧＧＴＴＴ

ＩＴＳ－ｂａｓｅｄＰｒｉｍｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲＡｓｓａｙｏｆＬｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓＳｔｒａｉｎｓ

ＹＡＮＧＹｏｎｇ－ｂｉｎ，ＬＩＮＹｕａｎ－ｃｈｏｎｇ，ＬＡＮＪｉａ－ｘｉ，ＹＡＮＧＳｈｕ－ｙｕｎ，ＸＩＥＦｕ－ｑｕａｎ，ＹｉＨｏｎｇ

（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｄｉｂｌｅ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＭｕｓｈｒｏｏｍ，ＦｕｊｉａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｉｌｋｗｏｒｍ＆Ｍｕｌｂｅｒｒｙ，ＦｕｚｈｏｕＦｕｊｉａｎ３５０００３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｒｅｉｇｏｎｈａｓｂｅｅｎｏｆｔｅｎｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｄｕｅｔｏｉｔｓｈｉｇｈｒａｔｅｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｕｎｉｖｅｒｓｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｒｉｂｏｓｏｍｅｐｒｉｍｅｒｓＩＴＳ１＆ＩＴＳ４ａｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅＩＴＳ５．８ｓｒＤＮＡｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｔｈｉｒｔｅｅｎＬｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓｓｔｒａｉｎｓ，ａｎｄｔｈｅｎｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｅｓｅＩＴＳ５．８ｓｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｆｔｅｒａｃａｒｅｆｕｌａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ｔｗｏｐａｉｒｓｏｆＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓ（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄｐａｉｒｐｒｉｍｅｒ１ａｎｄｐａｉｒｐｒｉｍｅｒ２）ａｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｓｅｒｖｅｄａｓｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙａｍｐｌｉｆｙｏｎｅｐｉｅｃｅｏｆＩＴＳ５．８ｓｒＤＮＡｆｒｏｍｓｔｒａｉｎＬ９０１５ａｎｄｓｔｒａｉｎＣｒ０２．ＲｅｓｕｌｔｓｈｏｗｓｏｎｅｐｉｅｃｅｏｆＤＮＡ（ａｒｏｕｎｄ５４０ｂｐｉｎｌｅｎｇｔｈａｎｄａｏｎｔｈｅｒ（１８０ｂｐ）ａｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｓｔｒａｉｎＬ９０１５ａｎｄｓｔｒａｉｎＣｒ０２ｒｅｓｐｅｃｉｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｅｎｔｉｎｕｌａｅｄｏｄｅｓ；Ｓｔｒａｉｎ；ＩＴＳ５．８ｓｒＤＮＡ；ＳｐｅｃｉｆｉｃＰＣＲｐｒｉｍｅｒ