杠扬保 ２０１７．４３（４）：１４５～１５０ 基于ＳＲＡＰ标记的黄瓜霜霉菌遗传多样性分析 白玲玲 ， 刘行风 ， 陈政瑜 ， 周莹莹 ， 刘 丽 ， 张艳菊 ， 张 奥 ， 杨 森 （１．东北农业大学农学院，哈尔滨摘要１５００３０；２．黑龙江省哈尔滨市阿城区种子服务中心，哈尔滨１５００３９） 本研究对来自黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏５个省１２个黄瓜主产区的７７个黄瓜霜霉菌菌株，采用ＳＲＡＰ 分子标记进行了遗传多样性分析。从３５对ＳＲＡＰ引物中筛选出１Ｏ对引物，生９ ５５４条扩增条带，其中９ １３２ 条表现多态性，占９５．６ 。基于ＳＲＡＰ分子标记，７７个黄瓜霜霉菌菌株的遗传距离为０．６Ｏ～１．ｏｏ，表明黄瓜霜霉 菌具有丰富的遗传多样性。通过聚类分析，７７个黄瓜霜霉菌菌株聚类为８个类群，并且来自相同地区的菌株大多 数聚集于同一类群中，表明黄瓜霜霉菌群体的遗传多样性与其地理来源密切相关。 关键词黄瓜霜霉病； 分子标记； ＳＲＡＰ； 群体遗传 中图分类号： Ｓ ４３６．４２１．¨ 文献标识码： Ａ ＤＯＩ： １０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９—１５４２．２０１７．０４．０２７ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＲＡＰ ｍａｒｋｅｒｓ Ｂａｉ Ｌｉｎｇｌｉｎｇ ，Ｌｉｕ Ｘｉｎｇｆｅｎｇ ，Ｃｈｅｎ Ｚｈｅｎｇｙｕ ，Ｚｈｏｕ Ｙｉｎｇｙｉｎｇｚ，Ｌｉｕ Ｌｉ ， Ｚｈａｎｇ Ｙａｎｊｕ ，Ｚｈａｎｇ Ａｏ ，Ｙａｎｇ Ｓｅｎ （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００３０，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｅｅｄ ｅｒｖｉＳｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆＡｃｈｅｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｉｎ Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ １５００３９，Ｃｈｉａ）ｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓａｍｐｌｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ １ ２ ｍａｊｏｒ ｃｕｃｕｍｂｅｒ—ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ５ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｈｅｂｅｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，ａｎｄ Ｊｉａｎｇｓｕ ｉｎ Ｃｈｉｎａ。ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＲＡＰ）．Ｔｅｎ ｏｕｔ ｏｆ ３５ ＳＲＡＰ ｐｒｉｍ— ｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ７７ Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ，ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ９ ５５４ ｂａｎｄｓ，９ １３２ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ，ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ９５．６％．Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ７７ Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０．６０ ｔｏ １．００ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳＲＡＰ ｍａｒｋｅｒｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ａ ｈｉｇｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ７７ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ ８ ｇｒｏｕｐｓ． Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｒｅａ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｇｒｏｕｐ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＵＰＧＭＡ ｍｅｔｈｏｄ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗａｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ； ＳＲＡＰ；ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ 由藻物界卵菌门古巴假霜霉菌Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓ— ｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ＆Ｃｕｒｔｉｓ）Ｒｏｓｔｏｖｚｅｖ侵染 霉菌在种内保持高度的遗传一致性，而种问遗传存 在差异且与亲缘关系有密切的关系。Ｓａｒｒｉｓ等＿＿４ 利 用ＡＦＬＰ对来自捷克、克里特岛、法国和荷兰的黄瓜 引起的霜霉病是黄瓜生产上的重要叶部病害。该病 害广泛分布于世界各地，在适宜条件下，传播流行速 度极快，一到两周时问即可造成叶片全部枯死，对黄 霜霉菌菌株进行了遗传多样性研究，发现霜霉菌菌 株被划分为２个的类群，一个类群为捷克、法国 瓜生产威胁极大［１ ］。 目前，国内外学者利用不同的分子标记技术对 黄瓜霜霉菌遗传多样性开展了相应的研究。Ｗａｎｇ 等［。 通过对ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列进行研究认为，黄瓜霜 和荷兰的所有菌株；另一个类群为克里特岛的菌株， 分析表明，菌株遗传多样性与其地理起源、寄主品种、 致病型和对杀菌剂抗性有关。Ｑｕｅｓａｄａ－Ｏｃａｍｐｏ等 通过对黄瓜霜霉菌的群体遗传结构分析，构建了全球 收稿日期：２０１７—０２—１９ 修订日期：２０１７—０４—０５ 基金项目： 国家自然科学基金（３１１７１７９２）；黑龙江省自然科学基金重点项目（ＺＤ２０１６００３） ＊通信作者 Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｙａｎｊｕ１９６８＠１６３．ｃｏｍ ・ １４６ ・ 勉扬保 ２０ｌ７ 第一个黄瓜霜霉菌群体遗传结构图。Ｐｏｌａｔ等。】采用 ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ分子标记对以色列、捷克和土耳其的 ８７个黄瓜霜霉菌菌株进行分析，证实菌株问具有显著 的遗传多样性，采白土耳其和捷克的菌株表现出一致 的遗传背景，而以色列的菌株则明显不同，认为可能 是由于菌株迁移或有性生殖现象引起的。在中国，刘 艳玲等 对中国１２个城市的３４株黄瓜霜霉菌的 ＮＡ＿Ｉ ｒＳ序列进行ＳＮＰ分析表明，菌株来源与地理区 域存在一定的相关性，菌株问在遗传上存在较大的差 异。张艳菊等ｆ｛］利用２７个ＲＡＰＤ随机引物对１８株 黄瓜霜霉菌进行全基因组Ｉ）ＮＡ的ＰＣＲ扩增，获得 ＲＡＰＤ标记共２３０个，发现各菌株之间的相似性系数 较低，在基因组ＤＮＡ水平上存在差异，具有丰富的遗 传多样性。 相关序列扩增多态性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ—ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉ— ｌｆｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＲＡＰ）是一种基于ＰＣＲ的分 子标记技术 ，具有快速、可靠、高效、低成本、无需 知道基因组的序列信息等优点［１。］，已经成功应用于 遗传多样性分析、遗传图谱的构建、重要性状的基因 定位等方面的研究。Ｔａｎｇ等ｌ１ 采用ＩＳＳＲ和 ＳＲＡＰ分子标记，对中国的３４株栽培木耳Ａｕｒｉｃｕ— ｌａｒｉａ ａｕｒｉｃ’ｕｌａ的遗传多样性进行了分析，认为 ＳＲＡＰ的分类更细，内容更丰富。Ｉ ｉｕ等［１ 采用 ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ和ＳＲＡＰ三种标记对香菇Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ的遗传多样性进行了分析，成功转化为 ＳＣＡＲ标记。Ｚｈａｎｇ等［１。 利用ＩＳＳＲ和ｓＲＡＰ分子 标记对金顶侧耳Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｆ ｒ ０ ｚ 以 “ 进行了 遗传多样性分析，并建立了其系统发育进化树，利用 ＳＲＡＰ分子标记将菌株分为了６个类群，表现出较 高的遗传多样性水平。Ｚｈａｎｇ等［１ ］利用ＳＲＡＰ标 记分析了猪苓Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ的遗传多样性。 Ｍａ等 ｌＩｌ对中国东北的１３个地区的松口蘑Ｔｒｉｃｈｏｌｏ 删ｍａｔｓｕｔａｋｅ进行了遗传多样性鉴定，发现菌株问的 遗传距离与地理隔离具有极高的正相关性。 本文利用ＳＲＡＰ分子标记对采自我国５个省 １２个黄瓜主产区的黄瓜霜霉菌群体进行遗传多样 性研究，了解霜霉菌遗传多样性和演化关系，为有效 防治黄瓜霜霉病提供理论依据。 ｌ材料与方法 １．１供试菌株 ２０１４年至２０１５年，在黄瓜霜霉病盛发期，从黑 龙江、辽宁、山东、河北、江苏５个省１２个黄瓜主产 区的温室大棚中采集７７个黄瓜霜霉病样品（表１）， 用于ＳＲＡＰ分析。 １．２试验方法 １．２．１ ＤＮＡ提取 黄瓜霜霉菌基因组ＤＮＡ的提取采用（；ＴＡＢ方 法 ］，稍加改良。ＤＮＡ的纯度与浓度使用紫外分光 光度计（ＤＵ６００，Ｂｅｃｋｍａｎ，美国）检测后，置于一２Ｏ。Ｃ 保存待用。 １．２．２ ＳＲＡＰ反应体系和反应程序 ＰＣＲ反应总体积为２０ Ｉ ，其中１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ （含２０ ｍｍｏｌ／Ｉ Ｍ 。。）２．０ ｔＡ ，ｄＮＴＰｓ（各２．５ ｒｅｔｏｏｌ／ Ｉ ）２ Ｉ ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／ｕＩ ）０．３ 【 ，ｄｄＨ２（）１２．７ Ｉ ， 上下游混合引物（１０ ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ）ｌ Ｌ，模板ＤＮＡ （５０ ｎｇ／￣Ｉ ）２ Ｉ 。反应程序为：９４｜Ｃ预变性３Ｏ ｓ；９４ 变性１ ｍｉｎ，３５ Ｃ退火３０ Ｓ，７２”Ｃ扩展１ ｍｉｎ，进行３个 循环；然后９４℃变性１ ｍｉｎ，５０”Ｃ退火１ ｍｉｎ，７２。Ｃ扩展 １ ｍｉｎ，进行３５个循环；７２ Ｃ延伸１０ ｍｉｎ；４ Ｃ保存。 １．２．３ ＳＲＡＰ引物筛选 ７个ＳＲＡＰ上游引物和５个ＳＲＡＰ下游引物 （表２）由上海生物工程有限公司合成，随机组合成 ３５对引物，选取３个模板ＤＮＡ分别进行ＰＣＲ扩 增，筛选扩增条带清晰，重复性和多态性显著的引 物，用于本研究黄瓜霜霉菌遗传多样性分析。 １．２．４ ＳＲＡＰ分析 在ＰＣＲ扩增产物中加入２ Ｌ加样缓冲液，用８ 的非变『生聚丙烯酰胺凝胶检测。凝胶大小为１８０ ｃｍＸ １２０ ｃｍＸ１ ｎ＇ｌｔ＇ｎ，电泳缓冲液为ｌ×ＴＢＥ，每个点样孔加 ２．０ ＶＩ 样品，１８０Ｖ恒压下电泳约１．０ ｈ。电泳结束后， 进行银染。先将胶放入固定液中，轻摇７～８ ｍｉｎ；倒掉 固定液，加入渗透液，轻摇１０ ｍｉｎ左右；倒掉渗透液，蒸 馏水水洗３０ ｓ；倒掉蒸馏水后，加入显色液，轻摇至 ＤＮＡ条带显出为止；倒掉显色液，用蒸馏水洗１次；倒 掉蒸馏水，加入终止液终止反应；统计带型并照相。 １．２．５数据分析 在ＰＡＧＥ胶上同一位置，出现条带的记为“ｌ”， 无条带的记为“０”，生成“０”和“１”组成的原始矩阵。 利用软件ＮＴＳＹＳｙＰＣ（ｖｅｒ．２．１）中的ＳＩＭＱＵＡＬ程序 计算菌株间相似系数（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ），获得 相似系数矩阵。利用其中的ＳＡＨＮ程序和ＵＰＧ— ＭＡ方法进行聚类分析，通过Ｔｒｅｅ Ｐｌｏｔ模块建立聚 类分析树状图。 ４３卷第４期 白玲玲等：基于ＳＲＡＰ标记的黄瓜霜霉菌遗传多样性分析 表１ 黄瓜霜霉菌菌株名称及来源 Ｔａｂｌｅ １ Ｎａｍｅ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｏｒｉｇｉｎｓ ・１４７・ 编号Ｎｕｍｂｅｒ 。 株韬铩 … Ｉｓｏｌａｔｅ ｃｏｄｅ ０ 每债ｅ麟 ｜｜来穗 一一。蜒 ｜ 。缩号 Ｎｕｍｂｅｒ 蘑 廉名税｜一 年份Ｉｓｏｌａｔｅ ｃｏｄｅ。 Ｙｅａｒ｜ 来源 Ｏｒｉｇｉｎ ＆Ｐ１ Ｐｃｅ－ｈ１ｌａ）ｊ４－ 毒 ｔ２ｍ ０１４ ｜ 羹说 雀赡ｓ 群铄筷赛赢 薹｜｜ 萋 蒸 誓 蓁 妻 ８ Ｐｃ－ｈｌｊ８， ２０ｔ４｜ ｊ。黑老扛笞，磅力 彦浠 囊 ２结果与分析 ２．１ 黄瓜霜霉菌基因组ＤＮＡ的提取 霉菌菌株进行ＰＣＲ扩增，从中筛选出１Ｏ对多态性 好、带型清晰的引物组合（表３）。利用这ｌｏ对引 物对７７个黄瓜霜霉菌菌株进行ＳＲＡＰ分析，总共 扩增出条带９ ５５４条，大小为１００～５ ０００ ｂｐ不等， 其中９ １３２条为多态性条带，多态性比率为 ９５．６ 。引物组合Ｍｅ９／Ｅｍ１４扩增出的条带数最 多，达１ ４０６条；引物组合Ｍｅ２／Ｅｍ４扩增出的条带 数最少。每个ＳＲＡＰ引物对扩增出的平均条带数 为９５５条（表３）。 所提取的黄瓜霜霉菌基因组ＤＮＡ经１ （ｗ／ｖ） 琼脂糖凝胶电泳检测（图１），显示条带清晰完整，无 拖尾现象，ＤＮＡ无降解，可满足ＳＲＡＰ分子标记 研究。 ２．２ 黄瓜霜霉菌ＳＲＡＰ－ＰＣＲ结果 采用上、下游引物自由组合的３５对引物对霜 ・ ｌ４８ ・ ｉ 翰镛 婚 ２０１７ ５ ３，－ ， ㈣㈣㈣ ㈨ 图１ １％琼脂糖凝胶电泳检测部分黄瓜霜霉菌基因组ＤＮＡ Ｆｉｇ．１ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ｓｏｍｅ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｏｌｓａｔｅｓ ｂ￣ｓｅｄ ｏｎ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ－ｓｔａｉｎｅｄ １％ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ 表２用于黄瓜霜霉菌遗传多态性分析的ＳＲＡＰ上、下游引物序列 Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＳＲＡＰ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ 上游引物名称 Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｍｅ２ Ｍｅ３ Ｍｅｄ Ｍｅ６ Ｍｅ８ 引物序列（５＇３ ） Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ ３ ） Ｉ、（；ＡＧＴ【、【、ＡＡＡＣ【、（；（ Ａ（ Ｃ Ｉ＇ＧＡＧＴ（１（、ＡＡＡ（、（、（；ＧＴＧＴ Ｔ（ ＡＧＴＣＣＡＡＡＣ（ （ｊ（ｊＡＡＴ ｒ（ Ａ（ｊ ｒ【、 ＡＡＡＣ（、【Ｘ；ＡＴＧ ｒ（ ＡＧ ＦＣＣＡＡＡＣＣ（；（ Ａ（；Ｃ 下游引物名称 Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ Ｅｍ４ ＥｎＩ７ Ｅｍ９ Ｅｍｌ０ Ｅｍｌ ４ 引物序列（５＇３ ） Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ 一３ ） （ ＡＣＴＧＣＧ＇Ｉ、ＡＣ（；ＡＡｒｒＴＣＡＧ ＧＡ（、ＴＧ（’（；ＴＡＣ（ ＡＡ１ ＡＣ （ ＡＣＴ（；（、（；ＴＡＣＧＡＡＴＴＡＴＧ ＧＡＣＴＧ（、ＧＴＡ（℃ＡＡＴＴ（’ＡＡ ＧＡＣＴ【ｊ（、Ｇ－ＴＡＣＧＡＡ ｒＧＴＣ Ｍｅ９ Ｍｃ１２ Ｔ（；ＡＧＴ（、（、ＡＡＡＣＣＧＧＡ人Ｇ ＴＧＡＧＴ（、Ｌ、ＡＡＡＣ（、（；【；ＴＡＧ 表３ ｌＩ）对引物组合对７７个黄瓜霜霉菌菌株ＳＲＡＰ扩增结果 Ｆａｂｌｅ ３ ＳＲＡＩ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ７７ ｉｓｏｌａｔｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｅｓ ｕｓｉｎｇ １０ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ２．３ ＳＲＡＰ聚类分析 个．占总菌株数的２７．３ ；第二类群为江苏的２个菌 株（Ｐｃ－ｊｓｌ和Ｐｃ＇－ｊｓ２），占总菌株数的２．６ ；第三类群 利用软件ＮＴＳＹＳＰＣ（ｖｅｒ．２．１）对供试的７７个黄 瓜霜霉菌菌株基因组Ｉ）ＮＡ的ＳＲＡＰ－ＰＣＲ扩增条带的 数据进行统计分析。获得这些菌株问的聚类分析树状 为辽宁的ｌ６个菌株，占总菌株数２０．８ ；第四类群为 河北的所有菌株（１９个）和山东的部分菌株（１０个）， 共２９株，占总菌株数的３７．７９／６；第五类群为山东的２ 个菌株（Ｐｃ－ｓｄｌ和Ｐｃ－ｓｄ５）．第六类群为山东菌株Ｐ ｓｄ８和Ｐｃ－ｓｄ９；第七类群为山东菌株Ｐｃ－ｓｄｌ９；第八类 群为４个山东菌株Ｐｅ－ｓｄ２、Ｐｃ＿ｓ（１１３、Ｐｃ－ｓｄｌ２和Ｐｃ－ｓｄ１７。 图（图２）。由图可见，黄瓜霜霉菌群体遗传多样性比 较丰富。遗传分化较大，菌株间的相似系数在０．６０～ ｌ＿∞之间．在相似系数为０．７３时（图２），所有菌株被 分为８个类群。第一类群为黑龙江的所有菌株共２１ ４３卷第４期 白玲玲等：基于ＳＲＡＰ标记的黄瓜霜霉菌遗传多样性分析 ・１４９・ Ｐｃ－ｈｉｊ２ Ｐｃ．ｈＩｊ３ Ｐ．１Ｃｎ２ Ｃ．ＩＰｎ８ Ｐｃ．１ｎｌ０ Ｐｃ－Ｉｎｌ Ｃ．１Ｐｎ６ Ｐｃ—Ｉｎ７ Ｐｃ－ｌｎ３１ Ｐｃ．１ｎ２７ Ｃ一１Ｐｎ２８ Ｐｃ—Ｉｎ４１ Ｃ－ＰＩｎ４２ Ｐｃ，－ｌｎ３３ Ｐｃ－Ｉｎ３４ Ｐ－ＣＩｎ３５ Ｃ－ＩＰｎ３６ Ｐｃ－Ｉｎ３７ Ｐｅ－ｈｂ４ Ｐｅ－ｈｂ５ Ｐｃ—ｈｂｌ Ｐｅ—ｈｂ８ Ｃ．Ｐｈｂ９ Ｐｃ－ｈｂｌ０ ｃ－Ｐｈｂ２ Ｐｃ－１１ｂｌ １ Ｐｃ—ｈｂｌ３ ｃ—ｈｂ３ Ｐｃ－ｈｂｌ７ Ｐｃ－ｈｂ２０ ＰＰｃ—ｈｂ２３ Ｃ．Ｐｈｂｌ６ Ｐｃ－ｈｂ１８ Ｐｃ－ｈｂｌ９ Ｐｃ－ｈｂ２１ Ｐｅ－ｈｂｌ２ Ｐｅ－ｈｂ２２ Ｐｃ．ｓｄ６ Ｐｃ—ｓｄ７ Ｐｃ．ｓｄｌ０ Ｐｃ—ｓｄｌｌ Ｐｅ－ｓｄ２８ Ｃ－ｓｄ２２ ＰＰｃ—ｓｄ２７ Ｐｅ－ｓｄ１４ Ｐｃ—ｓｄｌ５ Ｐｃ—ｓｄ２０ Ｐｃ—ｓｄｌ Ｐｃ－ｓｄ５ Ｐｃ－ｓｄ８ ｃ－ｓｄ９ ＰＰｃ—ｓｄ１９ Ｐｃ．ｓｄ２ Ｐｃ—ｓｄｌ３ Ｐｃ－ｓｄｌ２ Ｐｃ－ｓｄ１７ ０．６０ ０．７０ ０．８Ｏ Ｐｏｅｆｎｃｉｅｎｔ ０．９０ １．０Ｏ 图２ ７７株黄瓜霜霉菌菌株基于ＳＲＡＰ标记的聚类分析图 Ｆｉｇ．２ Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ ７７ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＳＲＡＰ ｍａｒｋｅｒｓ ・ １５０・ 勉 纭 ２０１７ ３讨论 ＳＲＡＰ分子标记技术是利用一对设计独特的引 物扩增基因阅读框区域（ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｄ ｆｒａｍｅ， ＯＲＦ），上游引物特异性扩增外显子区域，下游引物 特异性扩增内含子及启动子区域。本研究对５个省 １２个黄瓜主产区的７７个黄瓜霜霉菌菌株的ＳＲＡＰ 进行了研究，从分子水平上揭示出黄瓜霜霉菌群体 遗传多样性比较丰富。聚类结果表明，来自黑龙江、 辽宁、江苏和河北的所有菌株分别聚类于同一类群 内，来自山东的菌株则聚类于５个不同的类群。此 研究结果一方面表明基于ＳＲＡＰ分析的黄瓜霜霉菌 群体遗传多样性与其地理来源存在密切的相关性， 同一地区来源的菌株归于相同的类群；另一方面也 可以看出，来自山东的菌株具有较高的遗传多样性。 突变和有性生殖被认为是病菌发生变异的主要 原因。由于病菌发生变异，产生新的基因型，从而使 菌株表现丰富的遗传多样性。２０１２年Ｚｈａｎｇ等＿１ ］ 在黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、宁夏、陕西和青海 省发现了卵孢子的存在，并证实越冬后的卵孢子翌 年仍具有活性，可以作为黄瓜霜霉病的初侵染源。 ２０１３年Ｃｏｈｅｎ等１］８＿报道来自我国山东、北京和黑 龙江的菌株同时存在两种交配型Ａ１和Ａ２，进一步 证实在这些地区病菌在自然条件下发生有性生殖。 Ｚｈａｎｇ等和Ｃｏｈｅｎ等的研究均在山东省发现病菌存 在有性生殖，表明进行有性生殖以及异宗配合的病 菌，由于发生了遗传物质的重组，因此比不进行有性 生殖的病菌具有更大的变异性，产生具有更强适应 性、更多样化的新侵染性后代。这些新的后代往往 具有相对强的侵染性和复杂的毒力结构，并逐渐取 代适应性和侵染性较弱的种群，成为优势种群，使病 害发生更加严重。张艳菊等［１ 于２０１５年报道，相 比于黑龙江、吉林、辽宁、北京等省份采集的菌株，来 自山东省的黄瓜霜霉菌菌株对杀菌剂嘧菌酯的抗性 水平最高，其原因可能是因为长期大量使用嘧菌酯 使菌株产生了抗药性，这也从另一方面解释了来自 山东的病菌具有较高遗传多样性的原因。 迄今为止，教科书及多数学者对黄瓜霜霉病的 初侵染源还未形成定论，认为由于北方高寒地区冬 季没有黄瓜种植，推测这一地区的初侵染源可能是 由发病较早的地区随季风吹来的孢子囊释放游动孢 子侵染所致。但是，Ｚｈａｎｇ等＿ｌ ］的研究结果表明黑 龙江、吉林、辽宁、河北、山东、宁夏、陕西和青海省等 地黄瓜霜霉菌均发现存在卵孢子，并可作为黄瓜霜 霉病发生的初侵染源。Ｃｏｈｅｎ等［１ ８ｌ的报道也有力 地支持了Ｚｈａｎｇ等ｌ１ ］的结论。本研究通过对黄瓜 霜霉菌遗传多样性的研究，发现同一地区菌株相似 性较高，而不同地区菌株问相似性较低，从分子水平 证实黄瓜霜霉菌与地理来源存在相关性。 参考文献 ［１］Ｌｅｂｅｄａ Ａ，Ｃｏｈｅｎ Ｙ．Ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ（Ｐ “ｃ， 户Ｐｒｏｎ『Ｊ ｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）一ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｃｏｌｏｇｙ，ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ｈｏｓｔ—ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌ＿ｌ１］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２０１１，１２９（２）：ｌ５７—１９２． ［２］刘艳玲，张艳菊，蔡宁，等．黄瓜霜霉病病原与抗病性研究进 展＿Ｉ１］．东北农业大学学报，２００９，４０（４）：１２７—１３１． Ｅ３］ Ｗａｎｇ Ｎａ，Ｍａ Ｙａｊｕｎ，Ｙａｎｇ Ｃｕｉｙｕｎ，ｅｔ ａ１．ｒＤＮＡ １ Ｉ＇Ｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ ａｎｄ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｐｏｗ ｄｅｒｙ ｉｍｌｄｅｗ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，２００８，２（３）： ３１７—３２０． ［４］Ｓａｒｒｉｓ Ｐ，Ａｂｄｅｌｈａｌｉｍ Ｍ，Ｋｉｔｎｅｒ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｏｒ ｐｈｉｓｍｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｇｒｅｅｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｚｅｃｈ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ１ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００９，５８ （５）：９３３—９４３． ［５］Ｑｕｅｓａｄａ Ｏｃａｍｐｏ Ｉ Ｍ，Ｇｒａｎｋｅ Ｉ Ｉ ，Ｏｌｓｅｎ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｇｅ ｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｌ＿Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１２，９６（１０）：１４５９—１４７０． ［６］Ｐｏｌａｔ Ｌ，Ｂａｙｓａｌ Ｏ，Ｍｅｒｃａｔｉ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕ ｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｕｒｏｐｅ ａｎｄ Ａｓｉａ ｕｓｉｎｇ ＩＳ— ＳＲ ａｎｄ ＳＲＡＰ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，１３９（３）：６４１—６５３． ［７］刘艳玲，张艳菊，秦智伟，等．黄瓜霜霉菌卵孢子形成及ｒＤ— ＮＡＩ ＦＳ序列分析Ｃｃ］∥彭友良，朱有勇．中国植物病理学会 ２００９年学术年会论文集．北京：中国农业科学技术出版 社，２００９． ［８］张艳菊，张宏字，秦智伟，等．黄瓜霜霉菌毒性及分子多态性 分析ｌ＿Ｊ］．东北农业大学学报，２０１０（２）：２５—３０． Ｉ－９］Ｌｉ Ｇ，Ｑｕｉｒｏｓ Ｃ Ｆ．ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＳＲＡＰ）．ａ ｔｌｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＲ ｒｅａｃ ｔｉｏｎ：ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔａｇｇｉｎｇ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ＿ｌＪ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１，１０３：４５５—４６１． ［１０］陈碧云，伍晓明，陆光远，等．甘蓝型油菜花瓣缺失基因的图 谱定位ＥＪ］．遗传，２００６，２８（６）：７０７—７１２． ［１１］Ｔａｎｇ 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Ａ Ｅ，Ｌｉｕ Ｘ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒ ｒｅｎｃｅ ｏｆ Ａ２ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｃｕｒｂｉｔ ｄｏｗｎｙ ｍｉｌｄｅｗ ａｇｅｎｔ ［１４］Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｋａｎｇ Ｙ，Ｑｉｎ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄａｎ－ ｇｅｒｅｄ Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｅ— Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ＿Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１３， ９７（４）：５５９． ｑｕｅｎｃｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ＿Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，１１（４）：４１２１—４１２９． ［１９］张艳菊，王莹，党悦嘉，等．黄瓜霜霉菌对嘧菌酯抗药性的研究 ［Ｊ］．东北农业大学学报，２０１５（４）：２３—２８． ［１５］Ｍａ Ｄａｌｏｎｇ，Ｙａｎｇ Ｇｕｏｔｉｎｇ，Ｍｕ Ｌｉｑｉａｎｇ，ｅｔ ａ１．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ （责任编辑：杨明丽） 会 讯 第二十四届国际果树病毒及嫁接传播病害研究理事会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｆｔ Ｔｒａｎｓ— ｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ Ｃｒｏｐｓ，ＩＣＶＦ）于２０１７年６月４～９日在希腊瑟萨洛尼基召开。来自世界各地的近１００位学者参加了 会议。中国有两人参加了此次会议，分别是华中农业大学的王国平教授以及中国农业科学院植物保护研究所的李世访研 究员。该次大会包括４Ｏ个１３＇头报告以及３７个墙报，内容涉及植物病毒、类病毒和植原体等方面。其中６位学者作了特邀大 会报告，题目分别为： １、希腊果树的栽培生产现状及展望 ２、希腊果树病毒研究概况介绍 ３、侵染果树的类病毒：从接种到高通量测序（ＮＧＳ） ４、ＮＧＳ技术在植物病毒研究中的应用以及对果树无病毒种苗调运产生的影响 ５、果树植原体病害 ６、通过抑制寄主植物ＤＩＣＥＲ的表达打破植物的防御系统 此次大会的一个显著特点就是ＮＧＳ技术在果树病毒及果树病毒病害研究中的广泛应用。近乎一半的报告不论是口头报 告还是墙报中都提到了ＮＧＳ技术，说明该技术在研究果树病毒上的应用空间还很大。会议期间参观了希腊瑟萨洛尼基附近 的果园，考察了李痘病毒和桃潜隐花叶类病毒的发生分布以及危害状况。会后对ＩＣＶＦ的学术委员会进行了改选，新增委员５ 人。经过投票确定，第２５届ＩＣＶＦ会议将于２０２０年在荷兰召开。 （李世访，中国农业科学院植物保护研究所 北京 １００１９３）
