一种可用于皮肤创伤修复的药物[发明专利]

*CN101732325A*

(10)申请公布号 CN 101732325 A(43)申请公布日 2010.06.16

(12)发明专利申请

(21)申请号 200810203429.5(22)申请日 2008.11.27

(71)申请人中国科学院上海生命科学研究院

地址200031 上海市岳阳路320号申请人上海生茂投资有限公司(72)发明人翟钰栋 张晓坤 曾锦章 储瑞蔼(74)专利代理机构上海专利商标事务所有限公

司 31100

代理人范征(51)Int.Cl.

A61K 31/575(2006.01)A61P 17/02(2006.01)

()发明名称

一种可用于皮肤创伤修复的药物(57)摘要

本发明公开了一种可用于皮肤创伤修复的化合物，所述的化合物具有式(I)所示的结构：

权利要求书 2 页 说明书 9 页 附图 2 页

所述化合物

具有非常优异的促进皮肤创伤修复的效果，同时能够明显地促进皮肤细胞的迁移；减少创伤后瘢痕形成；促进β-连环蛋白蛋白降解；以及促进细胞中基质金属蛋白酶的分泌。所述化合物效果良好，可完全通过人工方式合成，且制备、储藏、运输成本低廉。

CN 101732325 ACN 101732325 A

权 利 要 求 书

1/2页

1.一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备修复皮肤创伤的组合物；

其中，R地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；

n为选自0-4的整数。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，R地选自：氢、羟基、C1-C2烷基、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；或者

n为选自1-3的整数。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式(II)结构：

其中，R的定义同权利要求1。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物具有式(III)结构：

其中，R的定义同权利要求1。5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于减少创伤后瘢痕形成。6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于促进细胞迁移。7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于促进β-连环蛋白降解。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于促进细胞中基质金属蛋白酶的分泌。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的基质金属蛋白酶选自：基质金属蛋白酶9，或基质金属蛋白酶2。

10.一种修复皮肤创伤的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐：

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CN 101732325 A

权 利 要 求 书

2/2页

其中，R地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、卤素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；

n为选自0-4的整数。

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说 明 书

一种可用于皮肤创伤修复的药物

1/9页

技术领域

本发明属于药学领域，具体地说，本发明涉及一种在皮肤创伤修复中有用的化合

物及其作用机制和用途。

[0001]

背景技术

创伤修复(wound healing)是指机体遭受外力作用，皮肤等组织出现离断或缺损

后的愈合过程，是一个众多可溶性媒介因子、血细胞、胞外基质和皮肤细胞参与，包含止血，炎症发生，皮肤及附属各组织的再生和胶原蛋白的合成以及肉芽组织增生、瘢痕形成等时序交叉的一个复杂的动态过程(Williamson，D.and K.Harding，Wound Healing.MEDICINE，2004；Singer，A.J.and R.A.F.Clark，Cutaneous Wound Healing.The New England Journal of Medicine，1999.341(10)：p.738-746.)。[0003] 据统计，中国每年皮肤创伤(如烧伤等)患者达到1500万人，随着近年来人们对创伤修复和组织恢复了解的加深，治疗手段有了一定的提高，但创伤愈合速度较慢以及瘢痕增生仍然是困扰患者的两大问题。目前外科手段主要是组织工程皮肤或患者自体皮肤的移植，但由于相关产品在生产、运输、保存、使用等环节上还存在较大的技术难度，生产和临床应用成本也居高不下，其前景并不十分令人乐观。另一方面，生物学治疗的主要焦点是选择局部应用FGF、EGF、PDGF、TGF等生长因子的载体，使之能持续、有效地在创伤处发挥作用，但是蛋白类产品因稳定性不佳和制备成本较高的特点其临床应用也受到很大。[0004] 因此，本领域还需要进一步研究和开发对于皮肤创伤修复有用，且稳定性好、成本低的物质。

[0002]

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种在皮肤创伤修复中非常有用的化合物，其具有稳定性好，成本低廉的特点。

[0006] 在本发明的第一方面，提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备修复皮肤创伤的组合物；

[0007]

其中，R地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷

氧基、卤素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；

[0009] n为选自0-4的整数(即n选自0、1、2、3或4)。[0010] 在另一优选例中，各个R相同或不同，R在不同的取代位置相同或不同。

[0008]

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CN 101732325 A[0011]

说 明 书

2/9页

在另一优选例中，R地选自：氢、羟基、C1-C2烷基、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；或

者

n为选自1-3的整数。

[0013] 在另一优选例中，所述的化合物具有式(II)结构：

[0012] [0014]

其中，R的定义同前述。[0016] 更佳地，所述化合物具有式(II’)结构：

[0015] [0017]

[0018] [0019]

在另一优选例中，所述的化合物具有式(III)结构：

[0020] [0021] [0022]

其中，R的定义同前述。

更佳地，所述化合物具有式(III’)结构：

在另一优选例中，所述的组合物还用于减少创伤后瘢痕形成。[0024] 在另一优选例中，所述的组合物还用于促进细胞迁移。

[0023]

5

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说 明 书

3/9页

在另一优选例中，所述的细胞选自：皮肤细胞，角质形成细胞，或上皮细胞。

[0026] 在另一优选例中，所述的组合物还用于促进β-连环蛋白(β-Catenin)降解。[0027] 在另一优选例中，所述的组合物还用于促进细胞中基质金属蛋白酶的分泌。[0028] 在另一优选例中，所述的基质金属蛋白酶选自：基质金属蛋白酶9(MMP-9)，或基质金属蛋白酶2(MMP-2)。

[0029] 在本发明的第二方面，提供一种修复皮肤创伤的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐：

[0030]

其中，R地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷

氧基、卤素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；

[0031] [0032]

n为选自0-4的整数。

[0033] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0034] 图1A显示了有熊去氧胆酸(UDCA)处理的HaCat细胞体外创伤实验(Invitro scratch assay)中细胞迁移的活动。

[0035] 图1B用图表量化了图1A中HaCat细胞迁移引起的划伤区域的变化。

[0036] 图2显示了UDCA及熊胆粉提取物对HaCat细胞中β-catenin蛋白降解的，以β-肌动蛋白作为上样量对照。

[0037] 图3显示了UDCA对HaCat细胞中基质金属蛋白酶MMP-9，MMP-2分泌的影响。具体实施方式

[0038] 本发明人经过广泛而深入的研究，从许多种化合物中首次筛选到一种具有式(I)结构的化合物，具有非常优异的促进皮肤创伤修复的效果。所述的式(I)化合物还能够明显地促进皮肤细胞(特别是角质形成细胞)的迁移；减少创伤后瘢痕形成；促进β-连环蛋白蛋白降解；以及促进细胞中基质金属蛋白酶的分泌。在此基础上完成了本发明。[0039] 化合物

[0040] 本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-4个碳原子(较佳地1-2个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。所述的“烷氧基”指的是含氧的烷基。[0041] 本文所用的术语“链烯基”包括含有至少一个碳碳双键和2-4个碳原子(较佳地2-3个碳原子)的直链和支链烃基。[0042] 本文所用的术语“链炔基”包括含有至少一个碳碳三键和2-4个碳原子(较佳地

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说 明 书

4/9页

2-3个碳原子)的直链和支链烃基。[0043] 本文所用的术语“卤素”指F、Cl、Br、或I。[0044] 其中，烷基、链烯基、链炔基、烷氧基等均可以含有或不含有取代基。例如，它们可以被含有1-3个(更佳地1-2个)选自(但不限于)：C1-4的烷基，C2-4链烯基，C2-4链炔基，卤素，-COORa，-NRaRb，-ORa，-CORa，-CONRaRb，＝O，-SRa，-SO3Ra，-SO2NRaRb，-SORa，SO2Ra，-NO2，-CN的基团所取代(其中Ra，Rb可以选自：氢，C1-4烷基，C2-4链烯基，C2-4链炔基)。本领域人员应理解，这些烷基、链烯基、链炔基、烷氧基等还可以被进一步地被取代。[0045] 本文所用的术语“异构体”包括：几何异构体、对映异构体、非对映异构体(如顺反异构体，构象异构体)。

[0046] 本发明首先提供了一种如结构式(I)所示的化合物：

[0047]

其中，R地选自：氢、羟基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷

氧基、卤素、氨基、-NH-(CH2)n-SO3H；n为选自0-4的整数。[0049] 较佳地，式(I)化合物中，R地选自：氢、羟基、C1-C2烷基、氨基、-NH-(CH2)

或者n为选自1-3的整数。n-SO3H；

[0048] [0050]

如的表示方法是本领域人员熟知的，其表示基团R可以取代在环上的

任意一个或多个可被取代的位置。并且，在不同的取代位置上，R的选择可以是不同的。本发明还包括上述化合物的异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前

体，只要它们也具有修复皮肤创伤、促进细胞迁移等作用。所述的“药学上可接受的盐”是指一类化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。[0052] 所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。

[0053] 作为本发明的一种优选方式，所述的化合物具有式(II)所示的结构。更优选地，所述的化合物具有式(II’)所示的结构。

[0051] [00]

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说 明 书

5/9页

作为本发明的一种更优选方式，所述的化合物具有式(III)所示的结构。更优选

地，所述的化合物具有式(III’)所示的结构。它们具有非常优异的皮肤创伤修复效果。

[0055] [0056]

[0057] [0058]

此外，一种式(I)化合物的药学上可接受的盐的形式例如式(IV)所示。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。[0060] 合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(19)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1995)中都有公开。

[0061] 一些式(I)化合物也可自生物(如动物或植物)中提取、分离和纯化。例如，式(II’)化合物可以从熊胆(或熊胆粉、熊胆汁)中提取获得，如互为差向异构体的熊去氧胆酸(即式(III’)化合物，化学名为3α-，7β-二羟基胆烷酸)和鹅去氧胆酸(化学名为3α-，7α-二羟基胆烷酸)。[0062] 用途

[0063] 基于本发明人的新发现，本发明提供了式(I)所示的化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体的用途，用于制备修复皮肤创伤的药物(或组合物)；或用于制备减少创伤后瘢痕形成的药物；或用于制备促进细胞(特别是皮肤细胞，更特别是角质形成细胞)迁移的药物；或用于制备促进β-连环蛋白蛋白降解的药物；或用于制

[0059]

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说 明 书

6/9页

备促进细胞中基质金属蛋白酶分泌的药物。[00] 在本发明的具体实例中，本发明人使用人类角质形成细胞进行细胞迁移试验。角质形成细胞作为构成皮肤表皮、毛囊的主要细胞成分，全程参与创伤后从炎症发生到组织重建的过程，它们的增殖速度，迁移程度，细胞因子和金属蛋白酶的分泌都关系到整个愈合过程。而角质形成细胞的迁移作为上皮重建中的重要事件(Li，J.，J.Chen，and R.Kirsner，Pathophysiology of acute woundhealing.Clinics in Dermatology，2007.25(1)：p.9-18.)，影响因素包括胞外基质、整合素受体、基质金属蛋白酶和生长因子，而其迁移的方向则主要受创伤部位新合成的V型胶原蛋白和细胞表面整合素受体的结合影响。促进角质形成细胞的迁移。

[0065] 在本发明的具体实例中，本发明人还验证了本发明的化合物对于细胞膜蛋白β-连环蛋白的影响。试验结果发现，本发明的化合物可非常有效地促进β-连环蛋白降解，从而可破坏上皮中的细胞黏连，促进细胞迁移。[0066] 在本发明的具体实例中，本发明人还验证了本发明的化合物对于细胞金属蛋白酶分泌的影响。金属蛋白酶MMPs不仅通过降解V型胶原蛋白和细胞表面整合素受体之间的黏连来影响细胞迁移的方向，并通过水解细胞合成的胶原蛋白来控制愈合后瘢痕的形成(Parks，W.C.，Matrix metalloproteinases in repair.1999.p.423-432.)。试验结果发现，本发明的化合物可非常有效地促进细胞分泌金属蛋白酶，特别是促进MMP-9和MMP-2的分泌。

[0067] 由于具有较少瘢痕的功效，本发明所述的化合物也可以作为一种对于美容有效的成分。

[0068] 组合物

[0069] 如本文所用，术语“本发明的组合物”通常是药物组合物，其含有式(I)化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体作为修复皮肤创伤的活性成分；以及药学上可接受的载体或赋形剂。所述的组合物也可以是一种美容制剂。[0070] 本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。[0071] 本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。[0072] 本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(I)化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。本发明还提供了制备修复皮肤创伤的组合物的方法，包括使用式(I)所示的化合物。可将有效量的式(I)化合物与药学上可接受的载体混合获得本发明的组合物，活性成分在组合物中的重量比例例如可以是0.0001-50wt％；较佳地可以是0.001-20wt％。[0074] 本发明的组合物也可以是一种中药提取物，其中含有本发明的式(I)化合物作为活性成分，提取可以采用一些已知的方法。例如通过中国专利《一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法》(申请号：200610027330.5)经水解、酸化、沉淀、结晶等步骤得到的总胆酸中，大量地含有熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸。所述的熊胆粉可以通过商购的途径获得。

[0073]

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说 明 书

7/9页

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效

地到达哺乳动物患处的剂型都是可以的。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是一种外用的制剂。比如可选自：搽剂、膏剂、凝胶剂、气雾剂、栓剂、粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液、或悬浮液。其中式(I)化合物或其异构体、外消旋体、药学上可接受的盐、水合物或前体可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体或辅料，如填充剂、矫味剂、抗氧化剂、香料、色素、润滑剂、助流剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。这些添加剂都是本领域人员所熟知的。[0076] 本发明还提供了一种修复皮肤创伤的方法，包括步骤：给需要的对象施用有效量的式(I)化合物。活性成分的给药量是治疗有效量。当外用时，本发明所述的化合物的安全有效量通常约0.1纳克/cm2-1毫克/cm2皮肤；较佳的约1纳克/cm2-0.1毫克/cm2皮肤。当然，具体剂量还应考虑给药途径、用药者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

[0077] 所述的组合物也可存在于膜状载体(如由无纺布制成)等载体上，从而可被施加于哺乳动物皮肤表面。此外，本发明所述的化合物还可与其他活性成分或治疗剂(如杀菌剂、消炎剂、抗生素等)一起使用。本发明的主要优点在于：

[0079] (1)本发明的化合物不仅可以促进皮肤创伤的修复，还可控制愈合后瘢痕的增生，以尽可能少影响皮肤伤后美观的手段。

[0080] (2)本发明的化合物在创伤后组织再生的细胞迁移过程中和肉芽组织向瘢痕转化过程中都具有使创伤向良性发展的作用。

[0081] (3)本发明的化合物完全可以通过人工合成的方式生产，这相对于临床现行的皮肤创伤愈合药物表皮生长因子(hEGF)等蛋白制品，大大降低了成本，简化了药物保存和运输的条件。

[0082] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，19)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件来完成。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。[0083] 实施例1[0084] 式(III)化合物在HaCat细胞的体外创伤修复模型中促进细胞迁移[0085] 即式(III)化合物即熊去氧胆酸，购自上海宁银商务发展有限公司，规格BR，纯度99.9％(w/w)。

[0086] 本实施例中使用的HaCat细胞(人类角质形成细胞细胞系，HumanKetinocyte cell line，购自中国典型培养物保藏中心，CCTCC))以含10％胎牛血清(四季青)的RMPI 10(Gibco)培养。

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[0087] 取生长于对数期的细胞以15×10/孔接种于12孔板(Corning)上，待细胞贴壁生长至形成铺满孔底的单细胞层时，在每个孔标记的位置以20μL的移液器吸头以相同手法快速在单细胞层上划出一条划痕，并以无血清的RMPI 10培液洗去细胞碎片。换液，分别以0.5％胎牛血清的RMPI 10配制的浓度为0和1μM的熊去氧胆酸处理，37℃

[0078]

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说 明 书

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0.5％CO2条件下培养12小时后，倒置显微镜下记录细胞群的迁移情况，在培养14小时的时间点上在相同标记处再记录一次迁移情况直至实验结束，并用Image Pro Plus(Meida Cybernetics，Inc.)测量迁移引起的划伤区域的面积变化。[0088] 结果如图1A和图1B所示。图1A结果显示，划伤形成12小时后，熊去氧胆酸处理的HaCat细胞向划伤区域迁移的程度高于不用药物处理的对照组，14小时的照片亦有同样的结论。而图1B则通过用Image Pro Plus比较不同处理时间划伤区域占计时开始时划伤区域面积的比例，更直观地体现熊去氧胆酸对HaCat在体外划伤条件下迁移的促进作用，并且这种影响在划伤发生后的12小时内即产生明显促进迁移的作用。[00] 实施例2[0090] 熊胆粉提取物、熊去氧胆酸对β-catenin蛋白的降解作用[0091] 1.熊胆粉提取物A和B的制备[0092] 按照中国专利《一种从熊胆粉中提取纯化熊总胆酸的方法》(申请号：200610027330.5)的方法，进行两次的提取过程，分别获得熊胆粉提取物A和熊胆粉提取物B。

[0093] 2.熊胆粉提取物对β-catenin蛋白的影响

本实施例中使用的免疫蛋白印迹检测(Western Blot)的方法参考《分子克隆实验

室手册》，具体方案如下：

[0095] 将HaCat细胞接种于40mm细胞培养皿中37℃ 0.5％CO2培养，待细胞生长至对数期后，分别以浓度为1μM的熊去氧胆酸，浓度为1μM的熊胆粉提取物A和浓度为1μM的熊胆粉提取物B来处理，同时设无药物添加的RMPI 10培液继续培养作为空白对照。培养12h后，以胰酶消化细胞，WIP细胞裂解液(20mM的Tris-HCl，150mM的NaCl和1％v/v的Triton X-100，pH 7.5)裂解细胞得到蛋白样品。[0096] Bradford法进行蛋白定量后，样品以SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转膜。纤维膜以5％的脱脂奶粉封闭，Santa Cruz公司的β-catenin抗体作为一抗，晶美公司的抗兔的二抗的作为二抗进行免疫印迹。然后采用ECL试剂盒(购自Amersham公司)显色得到胶片，结果如图2所示。

[0097] 由跨膜蛋白E-cadherin和膜蛋白β-catenin等蛋白成分形成的紧密黏连结构是维持上皮结构的重要细胞骨架，但是在细胞迁移过程中它们需要被降解。图2结果显示，在两种熊胆粉提取物和熊去氧胆酸的处理下，HaCat细胞中的β-catenin蛋白均有降解，这说明熊去氧胆酸可以通过降解β-catenin来破坏上皮中的细胞紧密黏连。[0098] 实施例3[0099] 式(III)化合物促进金属蛋白酶的分泌

[0100] 本实施例中使用明胶酶谱法(Gelatin Zymography)来检测熊去氧胆酸影响下的MMP-9和MMP-2的在HaCat的分泌变化。

[0101] 该实例中所用到的2×上样缓冲液为0.5M Tris-HCl pH 6.8，甘油，10％SDS，0.1％溴酚蓝四者以体积比5∶4∶8∶1混合而成。；Zymography Renaturing Buffer为2.5％(v/v)的Triton X-100溶于水；Zymography Developing Buffer为50mmol/LTris-碱，0.2M NaCl，5mmol/L CaCl2·(2H2O)和0.2％(w/v)Brij的水溶液

[0094] [0102]

具体方案如下：

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说 明 书

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按照2×104/孔的密度将HaCat细胞接种在96孔板上，待细胞贴壁后，分别以浓

度为10μM，1μM和0的熊去氧胆酸处理。37℃ 0.5％CO2培养12小时后，收集细胞上清并-80℃保存。[0104] 按照《分子克隆实验室手册》的方法制作含明胶浓度为1mg/mL的SDS-PAGE，每个处理的样品取相同体积与2×上样缓冲液等体积混合并放置10min，样品勿煮沸，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后凝胶须以ZymogramRenaturing Buffer室温下洗脱不少于15min×3次，而后Zymography DevelopingBuffer 37℃条件下过夜孵育。过夜处理得到的凝胶用考马斯亮蓝R250染色得到负染的MMP-9，MMP-2条带。结果如图3所示。[0105] 图3结果显示，u M级的熊去氧胆酸即可促进HaCat细胞中基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-2的分泌，从而促进了上皮再生和细胞迁移过程中基底膜和半桥粒的降解(Singer，A.J.and R.A.F.Clark，Cutaneous Wound Healing.TheNew England Journal of Medicine，1999.341(10)：p.738-746.)，并通过对胶原蛋白的降解实现组织重建完成后瘢痕的控制。

[0106] 实施例4[0107] 式(IV)化合物的制备及功能

[0108] [0109]

采用如中国专利申请CN01108398.0的方法制备牛磺熊去氧胆酸钠(结构式IV化

合物，化学名称为3α-，7β-二羟基胆烷酸-N-牛磺酸钠，分子式为C26H44O6NSNa)：

采用如实施例3所述的方法验证式(IV)化合物对细胞金属蛋白酶分泌的影响，结果发现，式(IV)化合物能够显著地促进细胞金属蛋白酶分泌。[0111] 综上所述，本发明的化合物可以促进皮肤角质形成细胞在体外创伤下的细胞迁移，这种促进作用在创伤发生后短时间内即显著发生。本发明的化合物对细胞迁移的促进作用可以通过调节细胞黏连蛋白β-catenin的降解以及增加基质金属蛋白酶MMP-9、MMP-2的分泌，但不仅仅局限于上述的途径来发生。本发明的化合物同时可以但不局限于通过调节组织重建过程中基质金属蛋白酶的分泌来控制愈后瘢痕的生成。[0112] 本发明通过多个实例证明，本发明的化合物作为一味保肝利胆的中草名药，亦能通过参与皮肤创伤后的组织再生、重建和瘢痕生成等病理过程在伤后愈合中起到加速愈合和减轻瘢痕增生的功效。且相对于现行的创伤治疗手段，其具有生产简单，运输保存方便，给药方式简单等优点，可非常好地进行临床应用。

[0113] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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