北磨盐学报 ２００９，１８（５）：３０２—３０５，３１１ Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｂｏｒｅａｌｉ—ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ Ｓｉｎｉｃａ 木质素降解菌筛选及葡萄枝条木质素降解研究 王 华 。，刘小刚 ，罗 华 ，杨 光 （１．西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌７１２１００；２．陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西杨凌７１２１００） 摘要：从腐烂的葡萄枝条中，分离筛选出产木质素降解酶活高及对葡萄枝条木质素降解能力强的微生物。 经分离纯化，获得２４株在愈创木酚培养基平板上产生变色圈的真菌。通过ＰＤＡ一愈创木酚平板显色和ＰＤＡ一 苯胺蓝平板退色反应，筛选出５株产木质素降解酶较高的菌株。对上述５菌株进行液态产酶和固态降解试 验。结果表明，Ａ一５１－１的木质素降解酶活性较高，其Ｌａｃ和ＭｎＰ酶活分别达９．２Ｏ和２１．６ Ｕ・ｍＩ ；葡萄枝 条经Ａ一５１—１处理３０ ｄ后，木质素的降解率为３２．５３ 。 关键词：木质素降解酶；葡萄枝条；降解率 中图分类号：Ｑ９３９．９６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—１３８９（２００９）０５—０３０２—０４ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇｎｉｎ。ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｆｕｎｇｉ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｌｉｇｎｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｎｅｙａｒｄ Ｐｒｕｎｉｎｇ ＷＡＮＧ Ｈｕａ ，ＬＩＵ Ｘｉａｏｇａｎｇ ，ＬＵＯ Ｈｕａ ａｎｄ ＹＡＮＧ Ｇｕａｎｇ （１．Ｃｏｌｌｏｇｅ ｏｆ Ｅｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ＆Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ：２．Ｓｈａａｎｘｉ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｖｉｔｉ ｖｎｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｉｇｎｉｎ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ Ｉ ｉｇｎｉｎ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈｅｒ Ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｅｃａｙｅｄ ｐｒｕｎｉｎｇｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ａ ｖｉｎｅ— ｙａｒｄ．Ｔｗｅｎｔｙ—ｆｏｕｒ ｆｕｎｇｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｃｏｌｏｒ ｚｏｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｇｕａｉａｃｏＩ ｐｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｆｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ Ｌｉｇｎｉｎ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｃｏｌｏｒｆｕｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＰＤＡ—Ｇｕａｉａｃｏｌ ｐｌａｔｅ ａｎｄ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｅｉｏｎ ｏｆ ＰＤＡ—Ａｎｉｌｉｎｅ ｂｕｌｅ ｐｌａｔｅ．Ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ—ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｔａｋｅｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ａ～５卜１ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｌｉｇｎｉｎ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ， ｆｏｒ ｉｔｓ ｌａｃｃａｓｅ ａｎｄ Ｍａｎｇａｎｅｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｕｐ ｔｏ ９．２Ｏ Ｕ・ｍＬ—ａｎｄ ２１．６ Ｕ・ ｍＩ 。。ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ：Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｎｅｙａｒｄ ｐｒｕｎｉｎｇｓ ｂｙ Ａ一５卜１ ｆｏｒ ３０ ｄ，ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｌｉｇｎｉｎ ｒｅａｃｈｅｄ ３２．５３ ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｉｇｎｉｎ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ；Ｖｉｎｅｙａｒｄ ｐｒｕｎｉｎｇｓ；Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ 近年来，我国葡萄种植面积不断扩大。截至 ２００７年，全国葡萄栽培面积４３．８４万ｈｍ ｌ１ Ｊ，居 木质素是自然界中仅次于纤维素的第二丰富 的有机可再生资源，也是微生物最难降解的成分 之一。在植物组织中，木质素能够与半纤维素共 价结合将纤维素包裹其内，以其难溶解性和复杂 的化学结构极大地了葡萄修剪枝条的降解利 用。进行高效木质素降解菌的筛选，已经成为一 个重要的研究课题。真菌是最有效的木质素降解 世界第５位。在葡萄园管理中，冬夏季节修剪出 的葡萄枝条越来越多。但传统上，葡萄枝条被随 意堆放或焚烧，造成资源严重浪费和环境污染。 进行果树枝条废弃物的生物降解及循环利用，开 始成为人们研究的热点。 收稿日期：２００９ ０３—０２ 修回日期：２００９～０４—２７ 基金项目：陕西省农业生态校园项目（ＳＴＸＹ ０３）。 作者简介：王华（１９５９－－），女，博士，教授，主要从事葡萄与葡萄酒研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈｕａｗｉｎｅ＠１２６．ｃｏｒｎ ５期 王 华等：木质素降解菌筛选及葡萄枝条木质素降解研究 微生物，尤其是白腐真菌（ｗｈｉｔｅ—ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ） ，可 通过一系列的酶促反应实现对木质素的彻底降 解。木质素降解酶类主要有３种：漆酶（Ｌａｃｃａｓｅ， Ｌａｃ）、锰过氧化物酶（Ｍａｎｇａｎｅｓｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒ— ｏｘｉｄａｓｅ，ＭｎＰ）以及木质素过氧化物酶（Ｌｉｇｎｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＬｉＰ）ｒ 。本文旨在筛选出产木质素降 解酶活高及对葡萄枝条木质素降解能力强的真 菌，为促进葡萄修剪枝条的综合利用奠定基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 样品采集 于２００８年４月，采集西北农 林科技大学东葡萄园实验基地的腐烂葡萄枝条。 １．１．２培养基愈创木酚培养基 ］：２．０ ６０目 葡萄枝条粉，０．１ 蔗糖，０．１ 蛋白胨，０．０２ 愈 创木酚，２．０ 琼脂。ＰＤＡ培养基（／Ｌ）：去皮马铃 薯２００ ｇ，蔗糖２０ ｇ，琼脂１６ ｇ。ＰＤＡ一愈创木酚培 养基：ＰＤＡ培养基中加入０．０４ 的愈创木酚。 ＰＤＡ一苯胺蓝培养基：ＰＤＡ培养基中加入０．１ ｇ・ Ｌ一 苯胺蓝＿５］。液态产酶培养基（／Ｉ ）：葡萄糖５．０ ｇ，酒石酸铵０．２ ｇ，ＫＨ２ＰＯ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ ・ ７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＣａＣＩ２ ０．１ ｇ，０．１ ｇ・Ｉ ～ｖＢ１溶液 １００ ｍＩ ，４０目葡萄枝条粉１０ ｇ，ＣｕＳＯ ・７Ｈ２ｏ ０．００７ ｇ，ＭｎＳＯ４ ０．０３５ ｇ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ ０．００６ ｇ，ＦｅＳ０４・７Ｈ２Ｏ ０．００５ ｇ，ＣｏＣＩ２・６Ｈ２Ｏ ０．００１ ｇ，吐温一８Ｏ １．０ ｇ，０．１ ｍｏｌ・Ｌ 乳酸缓冲液（ｐＨ ４．５）１００ ｍＩ 。固态培养营养液［ ：（／Ｌ）：ＮＨ Ｃ１ ２．０ ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ １．０ ｇ， Ｎａ２ＨＰＯ４ ０．２ ｇ，ＭｎＳＯ４ ０．０３５ ｇ，ＣｕＳ０ ・５Ｈ ２Ｏ ０．００７ ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００７ ｇ。 １．１．３ 葡萄枝条粉 于２００７年１２月在西北农 林科技大学北葡萄园实验基地，采集的赤霞珠葡 萄冬剪枝条，经洗净烘干后，粉碎成４Ｏ～６Ｏ目粒 度大小。 １．２方法 １．２．１ 菌株的分离与纯化 将采集的腐烂葡萄 枝条剪切成小碎片，分散接放于愈创木酚培养基 平板上，置２８℃下培养５～７ ｄ，挑选出能够在平 板上生长并产生变色圈的菌株。进行平板反复划 线，直至获得纯菌株。将纯菌株转接至ＰＤＡ平 板上，２８℃下培养７ ｄ后，用无菌打孔器在平板 上制造出直径为１０ ｍｍ、厚约为２ ｍｍ的菌饼，备 用。 １．２．２ ＰＤＡ一愈创木酚平板显色试验将制备好 的菌饼，于ＰＤＡ一愈创木酚培养基平板上后，置２８ ℃下培养５ ｄ，每天记录有无红棕色变色圈的产生 及变色圈直径的大小，有红棕色圈者记为＋，反 之记为一。根据变色圈所产生的时间及变色圈 的直径大小，检测出产Ｌａｃ较高的菌株 。 １．２．３ ＰＤＡ一苯胺蓝平板退色试验将制备好的 菌饼，置ＰＤＡ一苯胺蓝培养基平板上，并将平板置 ２８℃下避光培养１０ ｄ，记录蓝色培养基中有无退 色圈的产生及退色圈直径的大小，有退色圈者记 为＋，反之记为一。根据退色圈产生的时间及 退色圈的直径大小，检测出产ＭｎＰ和Ｉ ｉＰ较高的 菌株Ｅ５．９３。 １．２．４ 液态产酶试验 由１．２．２和１．２．３筛选 出产木质素降解酶类较强的菌株制备成菌饼，以 每瓶３个菌饼的接种量，接入已装有１００ ｍＩ 液 态产酶培养基的三角瓶（２５０ ｍＩ ）中，置２８℃下 １６０ ｒ／ｍｉｎ振荡培养１６ ｄ。每２ ｄ取样１次，测定 发酵液中Ｌａｃ和ＭｎＰ的活性。 １．２．５ 固态降解试验 向１００ ｍＩ 三角瓶中加 入２ ｇ葡萄枝条粉（４０￣６０目）和８ ｍＩ 固态培养 营养液，至固液混匀并显平坦状，于１２１ Ｃ高压蒸 汽灭菌３０ ｍｉｎ。将１．２．２和１．２．３所筛选出的菌 株制备成菌饼后，每瓶接种３个菌饼，于２８＿ｃ下 静止培养３０ ｄ。培养期间，适当补充水分以维持 瓶内的湿度。培养结束后，取出瓶内培养物，去除 表面覆盖的菌丝体，于１０５。Ｃ下烘干至恒重，测定 其中木质素、纤维素和半纤维素的含量及计算其 相对降解率。 １．２．６ 木质素降解酶活的测定方法Ｌａｃ的测 定参照文献Ｅｌｏ］，其中缓冲溶液采用５０ ｍｍｏｌ・ Ｉ 乙酸钠缓冲溶液（ｐＨ ４．５）。酶活定义为：每 分钟氧化１．０ ｔｔｍｏｌ愈创木酚所需的酶量为１个 酶活单位（Ｕ）。ＭｎＰ的测定方法参照文献［１１］。 ２４０ ｎｍ处Ｍｎ 摩尔消光系数为 ］：∈２ 。：８．１× １Ｏ。Ｌ・ｍｏｌ一 ・ｃｍ。 １．２．７ 木质素、纤维素和半纤维素含量的测定方 法 采用Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ方法Ｌ】 。 １．２．８木质素、纤维素和半纤维素的相对降解率 降解率一［木质素（或半纤维素、纤维素）的降解 总量／原样品中木质素（或半纤维素、纤维素）的总 量ｊ×１００ 。 西北农业学报 １８卷 ２ 结果与分析 ２．１ ＰＤＡ－愈创木酚平板显色反应结果 ２０、Ａ一０７—１、Ａ一４０—１、Ａ～２１、Ａ一０７、Ａ一５１—１等８个菌 株显色反应较快，显色圈直径较大。从而判断出， 这８个菌株具有较强的产Ｌａｃ能力。 ２．２ ＰＤＡ－苯胺蓝平板退色反应结果 从表１也可以看出，２４个菌株均可在ＰＤＡ一 经分离纯化，获得２４株在愈创木酚培养基平 板上产生显色圈的真菌。以２４菌株进行ＰＤＡ一 愈创木酚平板显色反应试验，结果见表ｌ。从表 １可以看出，２４个菌株均可在ＰＤＡ一愈创木酚平 板上产生显色反应，并随着培养时间的增加而不 断加强。不同菌株在显色反应时间和显色圈大小 苯胺蓝平板上产生退色反应。其中，Ａ一２１—１、Ａ一 ５６、Ａ一４８、Ａ一１８、Ａ一５１—１、Ａ一０３—２、Ａ一５１、Ａ～１４、Ａ一 ２ｌ、Ａ一４０—１、Ａ一０２、Ａ—ｌ１等１２个菌株产生退色反 应较快，退色完全。根据菌株产生退色反应的时 间及退色圈直径的大小，可判断出这１２个菌株具 有较强的产ＭｎＰ和Ｉ ｉＰ能力。 方面存在着差异，其中Ａ一２１—１和Ａ一４９产生显色 反应时间较慢，且显色圈小。而Ａ一１１、Ａ—Ｏ２、Ａ一 Ｔａｂｌｅ １ ｃ一：．． 表１ ２４个菌株的平板显色反应和退色反应结果 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒｆｕｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｐｌａｔｅｓ ｂｙ ２４ ｓｔｒａｉｎｓ 显色时间／ｄ Ｔｉｍｅ １ ２ ３ ４ ５ ２ ４ 退色时间／ｄ Ｔｉｍｅ ６ ８ ｉ０ Ａ—ｌ１ Ａ—Ｏ２ Ａ一２Ｏ ＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ 一 一 一 十 十 十 ＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ Ａ—Ｏ７一ｌ Ａ一４０ １ Ａ一２ｌ Ａ—Ｏ７ Ａ ５１—１ Ａ一４Ｏ Ａ一１４ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 土 ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ 一 一 一 一 士 一 一 ＋ 十 ＋ ＋ ＋＋ ＋ 十＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋十 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ Ａ一５１ Ａ １８ Ａ—Ｏ８ Ａ一４８ Ａ—Ｏ３—１ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋－ｈ＋ ＋＋＋ 一 ＋ 一 ＋ 一 十 ＋＋ ＋＋ ＋＋ 一 ＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ Ａ—Ｓ６ Ａ一２５ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ Ａ一０３ ２ Ａ ５５ Ａ一２１＿２ Ａ ｌ３ Ａ一０３ Ａ一４９ Ａ一２１ ｌ ＋＋ ＋ ＋ ± ＋ 一 一 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ± 一 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ 一 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ± ＋＋＋ ＋＋十 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ～ 一 ＋ 一 ～ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ± ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋十 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ 注：一不显色（或退色）；土开始显色（或退色）；＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋显色圈（或退色圈）逐渐增大。 Ｎｏｔｅ：一ｓｈｏｗｓ ｎｏ ｃｏｌｏｒ ｃｈａｎｇｅ（ｏｒ ｄｅｅｏｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ）；±ｓｈｏｗｓ ｔｏ ｂｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｌｏｒ（ｏｒ ｄｅｃｏｌｏｒｉｚｉｎｇ）；＋，＋＋，－＋－＋＋，＋＋＋＋ｓｈｏｗｓ ｂｉｇｇｅｒ ｃｏｌｏｒ ｚｏｎｅ（ｏｒ ｄｅｃｏｌ０ｒｉｚａｔｉ０ｎ）ｇｒａｄｕａｌｌｙ． ２．３ ５个菌株液态产木质素降解酶的活性 根据上述ＰＤＡ一愈创木酚平板显色反应和 着培养时间的延长酶活不断变化。自第４天起各 菌株的酶活明显提高，分别在６～８ ｄ达到产酶高 峰期。在第６天，Ａ一５１—１具有最强的产酶能力， 其最高酶活可达９．２０ Ｕ・ｍＬ ，是Ａ一２１的７．２４ 倍。Ａ—ｌ１与Ａ一４Ｏ一１的产酶能力相近，分别为 ＰＤＡ一苯胺蓝平板退色反应的结果，从中筛选出产 Ｉ ａｃ、ＭｎＰ和Ｉ ｉＰ能力均较强的５个菌株，即Ａ一 １ｌ、Ａ—Ｏ２、Ａ－４０－１、Ａ一２１和Ａ一５１－１。以５个菌株进 行液态产酶试验，测定发酵液中Ｌａｃ和ＭｎＰ的活 ６．２８和６．６１ Ｕ・ｍＩ 一。１０ ｄ后各菌株酶活逐渐 下降并趋于稳定。 从图２可以看出，５个菌株均具有较高的 性，结果见图１和图２。 从图１可以看出，５个菌株均可产Ｉ ａｃ，且随 ５期 王 华等：木质素降解菌筛选及葡萄枝条木质素降解研究 ｌ＾ ｕ《０ ８ ＾ ｌＩｌ＼ ｖ＼烬蹴 ６ ４ ２ Ｏ ＭｎＰ酶活。在第２天，Ａ一５１—１便可达到６．７９ Ｕ ・ｍＬ 的高酶活性，并在第８天达到最大产酶高 峰，酶活为２１．６０ Ｕ・ｍＩ ～。Ａ一１１在第４天以后 产酶能力较其他菌株明显增强，于第８天迅速达 到最高酶活２３．７７ Ｕ・ｍＩ ，是Ａ－２１的２．６９ ＾ 目 倍。第１０天后各菌株酶活逐渐下降，其中Ａ一５１— Ｖ １较Ａ—ｌ１下降平缓，仍具有较高的产酶活性。 ２．４ ５个菌株对葡萄枝条木质素的降解作用 经３０ ｄ固态培养后，５个菌株对葡萄枝条木 、 蜒 ｛睦 时间／ｄ Ｔｉｍｅ 图２ ５个菌株的ＭｎＰ酶活变化 Ｆｉｇ．２ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｍａｎｇａｎｅｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ５ ｓｔｒａｉｓ ｎ质素的降解作用见表２。从表２可以看出，Ａ一５１— １的木质素降解作用最强，降解率高达３２．５３ ， 为Ａ一２１的５。８５倍。Ａ一４０—１的木质素降解率为 ２９．Ｏ３ ，仅次于Ａ一５１—１。Ａ一１１和Ａ一０２具有相 近的木质素降解能力，其降解率分别为２３．８６ ２ ４ ６ ８ ｌ０ １２ １４ ｌ６ 时间／ｄ Ｔｉｍｅ 和２４．４４ 。同时５个菌株也具有较强的纤维素 和半纤维素降解能力。Ａ一５１—１、Ａ一４０—１和Ａ一１ｌ 的纤维素降解率分别达到４６．９９ 、３３．Ｏ７ ９／６和 １６．２１ ，对半纤维素的降解率均为５０ 以上。 图１ ５个菌株的Ｌａｃ酶活变化 Ｆｉｇ．１ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｌａｃｃａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ５ ｓｔｒａｉｎｓ 表２ ３０ ｄ后５个菌株对葡萄枝条木质素、纤维素和半纤维素的降解 Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｎｅｙａｒｄ ｐｒｕｎｉｎｇｓ ｌｉｇｎｉｎ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｈｅｍｉ－ｃｅｌｌｕｌｓｅ ｂｙ ｆｏｉｖｅ ｓｔｒａｉｓ ｆｏｒ ３０ ｄ ｎ注：空白。为未接种菌的重复处理。 ３ 小结 木质素降解菌在葡萄修剪枝条的综合利用方 面具有重要的应用研究价值。在枝条堆肥过 程 中，木质素降解菌剂有利于加快枝条木质素 态降解试验，结果表明，Ａ一５１—１具有较高的木质 素降解酶活，以及较强的木质素降解能力。并且 发现，Ａ一５１～１也兼有较强的纤维素和半纤维素降 解能力，这是由于木质素降解菌也能分泌出纤维 素酶和半纤维素酶 ］。 参考文献： ［１］ 中华人民共和国农业部编．中国农业统计资料（２００７）ＥＭＪ． 北京：中国农业出版社，２００８． ［２］Ｌｅｏｎｏｗｉｃｚ Ａ，Ｍａｔｕｓｚｅｗｓｋａ Ａ，Ｌｕｔｅｒｅｋ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｂｉｏｄｅｇｒａ— 的降解，缩短堆肥周期和提高堆肥产品质量 。 在饲料生产方面，木质素降解菌也有助于将葡萄 枝条转化成蛋白质含量丰富的反刍动物饲料。 采用愈创木酚培养基，直接从腐烂的葡萄枝 条上分离到产木质素降解酶的２４株真菌，并通过 ＰＤＡ一愈创木酚平板显色反应和ＰＤＡ一苯胺蓝平 板退色反应，筛选出产Ｌａｃ、ＭｎＰ和ＬｉＰ均较强 的５个菌株。以上述５个菌株进行液态产酶和固 ｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｉｎ ｂｙ Ｗｈｉｔｅ Ｒｏｔ Ｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，２７（２－３）：７５ １８５． （下转第３１１页） ５期 张海燕等：半根灌溉对成龄苹果树光合荧光及果实品质的影响 嘲 嘲 ・３１１・ 嘲 １＝ｌ 口 ＝Ｊ１ ｌ＝Ｊ 妇 叼 口 阳 （上接第３０５页） 吴坤，朱显峰，张世敏，等．杂色云芝产漆酶的发酵条件 研究［Ｊ］．菌物系统，２００１．２０（２）：２０７—２１３． Ａｎｎｅｌｅ Ｈａｔａｋｋａ．Ｌｉｇｎｉｎ—ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｈｉｔｅ—ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｆｒｏｍ ｉｎ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａ— 杜海萍，宋瑞清。王钰祺．几种真菌产木质素降解酶的比较 研究ＥＪ］．林业科技，２００６，３ｌ（４）：２０—２４． Ａｉｔｋｅｎ Ｍ Ｄ，Ｉｒｖｉｎｅ Ｒ Ｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｃａｔ— ａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙ— ｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００６，１３（２－３）：１２５— １３５ 张业录，赵华，孙希雯，等．木素降解菌的筛选和氯酚生物 ｓｏｓｐｏｒｉｕｍ［Ｊ］．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， ｌ９９０，２７６（２）：４０５—４１４． 降解研究［Ｊ］．天津轻工业学院学报，２０００（０４）：１７－２Ｏ。３５． 蔡磊，尹睃峰，杨丽萍，等．几种简便的木质素降解真菌定 杨胜．饲料分析及饲料质量检测技术（第一版）［Ｍ］．北 性筛选方法ＥＪ］．微生物学通报，２００２，２９（１）；６７—６９． 习兴梅，曾光明，郁红艳．等．黑曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ木质 纤维素降解能力及产酶研究口］．农业环境科学学报，２００７， ２６（４）：１５０６—１５ｌ１． 京：北京农业大学出版社，１９９３：５８—６３． 王引权，Ｆｒａｎｋ Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔ，张仁陟，等．葡萄枝条堆肥化过 程中的生物化学变化和物质转化特征［Ｊ］．果树学报， ２００５，２２（２）：１１５—１２０． 刘 敏，张 明．一株产漆酶菌株的筛选鉴定和发酵条件的 研究［Ｊ］．生物学杂志，２００８，２５（３）：４０—４３． 李呜雷，商鸿生，谷 洁，等．促进农业废弃物腐解的复合 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