AM-AM-FS-Jp-0019 维生素B1高效液相色谱法的定量测定

AMAMFSJp0019维生素B₁ 高效液相色谱法 定量

AM-AM-FS-Jp-0019

维生素B₁高效液相色谱法的定量测定

1.适用范围

本方法对大量的试料都能较简单、准确地进行食品中维生素B₁的定量测定。

2.原理概要

3.主要试剂和仪器

3.1.主要试剂

4mol/L醋酸钠溶液10mL；

高峰淀粉酶溶液：高峰淀粉酶用水溶解后，制成2%的溶液，注入过滤砂管中用通过液将混在高峰淀粉酶中的维生素B₁吸附。使用时调制；

5%KCl盐酸溶液：用0.1mol/L的盐酸溶液配制25%的KCl。若有结晶析出，可加热使之溶解；

过滤砂：将50-80mesh的过滤砂放入烧瓶中，加入4倍量的热水，搅拌、静置，倒掉上清液。重复次操作直至上清夜通明为止。然后加入4倍量的3%醋酸溶液同前一样操作进行清洗2回，进一步用3倍量的25%KCl盐酸溶液在沸水浴中进行25min的搅拌处理，再用3%醋酸溶液洗2次后，反复用水洗，直至在洗液中加入2-3滴AgNO3不变白浊为止。如此处理过的过滤砂或放在气密容器中的水中保存，或在60℃下干燥后保存；

蛋白质分解酶溶液：放线菌或细菌的0.2%的磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH6.8）；

二苯酰硫胺素标准溶液：准确称取一定量的标准品，加适量的0.1mol/LHCl，加热溶解，调制成（1-10）μg/mL溶液；

盐酸乙醇溶液：8.73mLHCl中加700mL乙醇后，以水定容至1000mL。

铁的氢氧化钠溶液：30gNaOH溶于200mL水中，然后加入20mg的铁溶之。用时调制；

维生素B₁标准溶液：用保证纯度的维生素B₁盐酸盐以10%的三氯醋酸溶解并配制成(10-1000)ng/mL溶液。该溶液与4 mol/L醋酸钠及2%的高峰淀粉酶溶液以20:3:1的比例混合即为维生素B₁标准溶液。

3.2.仪器

过滤砂管：硬质玻璃制作的吸附管的S的底部（图2.1.6-1）装有少量的玻璃棉，用水充满该底部。另取过滤砂（1.3-1.5）g加水20mL，轻轻振摇使吸附于过滤砂中气泡除去后，和水一同流入吸附管中。然后打开活栓，水流出后，使10mL3%的醋酸和20mL水分别以1mL/min的流速流过吸附管进行调整。使用后将过滤砂的上部留有少量的水放置；

效液相色谱仪：带有柱恒温箱，反应液混合用旋管（聚四氟乙烯制的0.3mm i.d×1m）,混合旋管用恒温箱,送液泵及荧光检测器。

1. 试验溶液用玻璃匀浆器。

4.过程简述

4.1.试验溶液的调制

4.1.1.一般试料：

     称取试料1g，放入含有5 mL10%的三氯乙酸的玻璃匀浆器中，进行均化。均化后的试料溶液用10%的三氯乙酸定容为10.0mL，倒入高速离心机用的离心管中，进行约30分钟的9000×g离心。取其上清液200μL于小试管中，加入4mol/L的醋酸钠溶液30μL（使pH4.5～4.7）。再加入高峰淀粉酶溶液10μL，充分搅拌后，在37℃温度下放置8～10小时，作为试验溶液。

4.1.2.高蛋白质试料：

乳制品、肉类、豆制品等含B₁较多，为了高效地提取，有必要用蛋白质分

解酵素进行前处理。将干燥的试料进行粉碎至可通过30 mesh筛孔程度，其他试料用均化器磨碎后准确称取约？g，加入5倍量的蛋白质分解酵素溶液，充分混合，加入5~6滴甲苯后在37℃恒温器内放置一夜。分解后加入和蛋白质分解酵素溶液同样量的0.2mol/L的H2SO4,在水浴上加热30min，热（？）时用折叠滤纸过滤，滤过的残留物用热水清洗，合并滤液。冷却后用4mol/L的醋酸钠溶液调pH4.5后加水定容至一定量，进行下面的酵素分解。

酵素分解：将试验溶液加入约2mL的酵素溶液，在（45～50）℃下保温2～3小时，或加5～6滴甲苯后在（37～40）℃恒温器内放置一夜。然后在沸水浴上温浸，冷却后用水定容至100.0mL，进行离心或过滤取其上清液。

吸附：将上述上清夜（pH4.5）的一定量（越含B1？μg的液量）慢慢地注

入到过滤砂管中，以？mL/min的流速使其进行吸附。接着用pH4.5的HCl15mL淋洗过滤砂管的R部。

水洗：吸附完了后，为了除去共存的盲荧光物质，将过滤砂管中注入沸水，以（3～4）mL/min的流速（约1滴/秒）清洗吸附层，直至洗液中无盲荧光物质为止。

解吸：水洗完后，将过滤砂管下部的接收器换成25mL容量瓶，，趁过滤砂

管热时加入10mL25%KCl-HCl溶液，通过调节活栓以1滴/秒的流速滴下，接收解吸液。若溶出液达到过滤砂的上层时，再次用沸溶出液？mL注入之进行同样的操作，最后注入同液7mL使解吸液总量为25mL，关闭活栓。将容量瓶在室温下放置，冷却后用水定容为25mL作为试验溶液。

4.1.3.淀粉质试料：

对米、小麦及以其为主体的制品进行如下前处理。将粉碎的试料过30 mesh筛孔，准确称取20g，加水80mL充分混合，加2～3滴醋酸调其pH4～5后，在沸水浴上边搅拌边加热30min。冷却后，加入5mL蛋白质分解酵素溶液，充分混合，加入5～6滴甲苯后在37℃恒温器内放置一夜（约16小时），加10mL浓度为1mol/L的H₂SO₄混合后,在沸水浴上边搅拌边加热30min。冷却后加水至100mL，用折叠滤纸过滤，滤液进行同高蛋白质试料2）的酵素分解后的操作。

4.1.4.难溶性B₁盐类强化试料：

难溶性B₁盐类从强化食品中提取出，一般用高浓度的HCl进行加热处理，

以B₁-HCl盐的形式提取出而得到试验溶液。

将粉碎或磨碎的试料称取约10g（相当于B₁-HCl盐100μg的量），添加B₁，萘-1，5-（或2，6-）二磺酸盐的情况下3mol/LHCl,还原酞盐的情况下1mol/LHCl,其他盐类与一般试料1）同样0.1mol/LHCl,分别加入50mL在沸水浴上加热30min进行提取。冷却后加入4mol/L的醋酸钠溶液调pH4.5进行同高蛋白质试料2）的酵素分解后的操作。

4.1.5.B₁诱导体强化试料：

i)二苯酰磺胺素（DBT）强化试料的提取：

准确称取一定量（通常10g以下的DBT相当于B₁-HCl盐100μg的量）于100mL的三角烧瓶中，加入50mLHCl·乙醇溶液充分摇匀，连接回馏冷却器，在80℃以下的水浴中进行30min加温提取。冷却后，将其内容物进行10分钟的2300×g（约4000rpm）离心，取其上清液于100mL容量瓶中。残留物再用50mL的HCl·乙醇溶液加热提取、离心，合并上清液，以HCl·乙醇溶液定容100mL。

碱化分解：取上述提取液1.0mL于具塞试管中，加入1mol/LNaOH溶液1.0mL摇匀，准确放置20（？）分钟后加入1mol/LHCl溶液1.5mL,使其恢复为酸性溶液作为试验溶液。标准DBT溶液进行同样的碱化分解后作为基准试液。

  ii) 苯酰磺胺二硫化物（BTDS）强化试料：

准确称取一定量（通常10g以下的BTDS相当于B₁-HCl盐100μg的量）于

100mL的三角烧瓶中，加入50mL0.1mol/LHCl溶液,在沸水浴加热30分钟。冷却后加10mg半胱胺酸盐酸盐，用1mol/LNaOH溶液调pH12~13后，在37℃下保温15min。再用1mol/LHCl溶液调pH4.5，加0.5g高峰淀粉酶，在50℃下保温2小时。保温后以水定容100.0mL，过滤或1300×g（约3000rpm）离心10min，取其上清液作为试验溶液。

4.2.高效液相色谱条件

   色谱柱：维生素B₁分离用〔polyglycerlmethacrylate,球状，15μm（6mm i.d ×250mm）〕

   移动相：0.1mol/LNaH₂PO₄溶液

   流  速：0.7mL/min

   反应液：0.01%K₃Fe(CN)₆·15%NaOH溶液（流速0.7mL/min）

   检出器：荧光检出器（激发：375nm,发射：450nm）

定量：试验溶液50μL注入色谱柱中，从色谱柱分离溶出的维生素B₁和由反应液送液泵送出的反应液自动混合，变成荧光物质（硫胺荧）。测得该荧光物质通过荧光检出器得到的色谱峰高（a）和50μL维生素B₁标准溶液的色谱峰高（b）.

5.结果计算：

100g试料中维生素B₁的量（μg/100g）用下面公式求得。

100g试料中维生素B₁的量（μg/100g）

=S×(a/b) ×10×(1/1000) ×(100/试料取样量（g）)

S—L维生素B₁标准溶液的浓度（ng/mL）

6.来源：

    《卫生试验法·注解》2000版  日本药学会编