AM-AM-FS-Eu-0004 氯霉素-用GC-MS确认肉、牛奶、鸡蛋和尿中存在氯霉素

AMAMFSEu0004肉 牛奶 鸡蛋 尿 氯霉素GC-MS法

AM-AM-FS-Eu-0004

氯霉素—用GC-MS确认肉、牛奶、鸡蛋和尿中存在氯霉素

1.适用范围

     这种方法用于进一步确认在肉、鸡蛋和尿中氯霉素的存在，对于牛奶也可采用更加适合的方法，氯霉素的检测限是0.1ug/l或kg。

2.原理概要

分析方法包括6步:尿:1）水解尿；2）Extrelut柱提取；3）SEP-PAK C18柱净化；

肌肉和鸡蛋:1）均质；2）用乙酸乙酯提取；3）SEP-PAK SIL柱净化；4）HPLC净化；5）衍生化；6）GC-MS分析。

3.主要试剂和仪器

3.1 主要试剂

氯霉素标准化合物C₁₁H₁₂CL₂N₂O₅；

内标³⁷CL₂—氯霉素；

乙醇；甲醇；异辛烷；乙腈；二氯甲烷；

盐酸；乙酸乙酯；醋酸；醋酸钠；硫酸钠；

Extrelut^R（MERCK公司）；

醋酸盐缓冲液2.0MOL/L，PH5.2:

25.2g醋酸加入600ml水混合，加入129.5g醋酸钠；调PH5.2±0.1，用水定容至1L。

HPLC洗脱缓冲液:

    乙醇/异辛烷（3:97  V/V）混合；

磷酸氢二钠Na₂HPO₄；

磷酸二氢钾KH₂PO₄；

固相混合提取溶液:

甲醇:水，10:90V/V，10ML甲醇加90ML水混合；

甲醇:水，45:55V/V，45ML甲醇加55ML水混合；

乙腈:水，20:80V/V，20ML乙腈加80ML水混合。

内标贮存液:1g/L乙醇溶液，-20℃暗处贮存。

内标工作液:0.01g/L乙醇溶液，4℃贮存，最多两周。

衍生化试剂:N，O-613（三甲基硅烷），三氟乙酰胺（BSTFA），含1%TMCS（三甲基硅烷）的三氟乙酰胺液。

葡糖苷酸酶/硫酸酯酶（SIGMA公司）

固相萃取小柱（SEP-PAKC18）

固相萃取小柱（SEP-PAK SIL）

3.2.仪器

HPLC系统:适合于提取物的纯化，紫外检测器（254nm）,Lichrosorb Diol 5um,150mmx4.6mm柱子；

GC色谱:SE-52，25M X 0.25MMID，液膜厚度0.25um毛细管柱；

GC-MS:质量分光光度计，CP-SIL-19CB（25M X 4.4MMID，液膜厚度0.25 um）毛细管柱。

4.过程简述

4.1采样:需要进一步确认氯霉素的存在的样品。

4.2 样品的制备

4.2.1尿样

4.2.1.1 水解:取10ml尿样，用醋酸调PH5.2，加入0.5ml 2mol/L醋酸盐缓冲液，PH5.2，加入20ul葡糖苷酸酶，37℃培养2小时，加入内标溶液。

4.2.1.2  Extrelut柱子净化

     准备一Extrelut柱子，把上述尿样缓冲液冷却加入2ml水混合，全部倒入柱中，吸附15min，用2*25ml乙酸乙酯洗脱氯霉素。

50℃减压蒸干乙酸乙酯，用2ml甲醇全部转移至含有5ml水的玻璃管中，重复二次，在N₂条件下，水浴50℃减少甲醇/水体积到4ml。

4.2.1.3 SEP-PAK C18柱净化

     首先用2ml甲醇洗小柱两遍，再用5ml水洗小柱，加入提取液，用5ml水洗小柱，再用5ml甲醇:水（10/90  V/V）洗柱子，最后用5ml甲醇:水（45/55 V/V）洗脱氯霉素，洗脱液在N_2，50℃条件下蒸干，进一步用HPLC净化。

4.2.2 牛奶

     适当脱脂后，提取步骤与尿样相同。

4.2.3 肉样和鸡蛋

4.2.3.1 提取

     用均质器均质200克肉样或鸡蛋，精确称取10克样品至250ml离心管中，加入100 mlL乙酸乙酯，30克硫酸钠，再均质1分钟，离心1800转30分钟，取出75ml上清液转移至150ml圆底烧瓶中，蒸干溶剂，加入内标。

4.2.3.2  SEP—PAKSIL柱净化

     首先用5ml乙腈:水（20/80，V/V）洗柱子，再用5ml二氯甲烷洗柱子，用N₂吹干小柱。提取物的残渣用5ml二氯甲烷溶解，上柱子，再用5ml二氯甲烷洗瓶子和柱子两遍，用N₂吹干至柱中无二氯甲烷，用5ml乙腈:水（20/80，V/V）洗脱氯霉素，用1ml乙酸乙酯提取洗脱液三次，合成提取液再用1ml水洗，通N₂在50℃水浴中旋转蒸干，准备HPLC净化。

4.3  HPLC净化

     把残留物用0.3ml洗脱液溶解，取0.25ml进HPLC，收集RT-0.5分钟～ RT+0.5分钟（RT为氯霉素的保留时间），在N₂在50℃水浴中蒸干溶剂，准备衍生化。

4.4 衍生化

     用少量乙醇把（4.3）残留物溶解，加入0.1mlBSTFA/1%/TMCS，盖上盖加热60℃，1小时，在N₂50℃条件下蒸干溶剂，加入25ml异辛烷。

氯霉素标准品也同时进行衍生化。

4.5.GC—MS分析，化学电离作用

     用质量光谱测定法测量确定氯霉素的残留量，或电子捕获阴离子化学电离作用（ECNICI），或者用电子撞击（EI）电离。

4.5.1 GC—ECNICI（MS）

     GC—MS系统，用一根CP—SIL—19CB毛细管柱，HE作为载气，柱头压力为1.1 X10⁵PA，不分流进样，进样口温度为260℃，进样后柱箱温度以1℃/分钟从最初的150℃增至270℃，GC和柱箱温度分别为260℃和270℃，发射源温度140℃，金属丝发射电流200UA，甲烷作为试剂气体，离子源压力50PA，最佳电能在70_~90EV，保压时间0.052S，根据离子数量，分析以SIM方式进行，M/2=376，378，466，468，470（内标物）

4.5.2 GC—EI（MS）

     GC—MS系统用一根SE—52毛细管柱，HE作为载气，柱头压力1 X10⁵，保压时间0.05S，M/2=225，242，361和451离子数量，分析以SIM方式进行。

4.6 添加步骤（定量和回收）

4.6.1 取10克或10毫升均质后的样品，添加0.1ml内标溶液，氯霉素添加量大约为最大量的一半，与样品彻底混合，室温放置30分钟，4℃过夜。

5.结果计算

5.1.与GC标准有相同的保留时间。

5.2.在扣除背景后，质谱峰中，选择离子。

5.3.GC—ECNICI（MS）选择与标准相同比值离子，分别为A468/466（R₁）在10%范围内，理论值为0.76。A378/376（R₂）。

6.来源：

  欧盟食品分析方法CY3.5